Izolácia DNA z Escherichia coli: Prehľad Techník a Aplikácií

S nástupom rekombinantných DNA technológií v 70. rokoch 20. storočia nastáva enormný rozvoj molekulárnej biológie, takže 21. storočie môžeme právom nazvať „érou biológie”. Pomocou rekombinantných DNA možno vnášať cudzie gény do živých organizmov, a tým modifikovať ich vlastnosti. Takéto cieľavedomé genetické manipulácie so živými organizmami, nazývané aj genetické inžinierstvo, sú dnes najkontroverznejšou oblasťou genetického výskumu.

Využívanie organizmov s modifikovaným genómom je základom pre komerčnú masovú produkciu látok (hormóny, proteíny) v biologických systémoch, ktoré sú zaujímavé z pohľadu spotrebiteľa. Táto oblasť patrí pod záštitu molekulárnych biotechnológií alebo skrátene len biotechnológií. Rekombinantné DNA technológie sú tiež základom génovej terapie, ktorá má do budúcnosti obrovský potenciál v riešení problémov genetických a onkologických ochorení, na ktoré klasickými metódami liek neexistuje.

Rekombinantné DNA sú molekuly zložené z dvoch a viacerých sekvencií DNA, ktoré sa prirodzene nikdy nenachádzajú spoločne (pri sebe). Sú to teda v laboratóriu vytvorené umelé molekuly molekulárnymi technikami využitím rôznych enzýmov, predovšetkým restrikčných endonukleáz (restriktáz). Izolace plasmidové DNA je v mikrobiologii důležitou a často využívanou metodou.

Princípy molekulárneho klonovania a úloha restrikčných enzýmov

Princípom molekulárneho klonovania je teda príprava rekombinantnej molekuly DNA, ktorá sa vnáša do nejaké hostiteľského organizmu (napr. baktérií alebo kvasiniek), pričom samotné klonovanie, tzn. zmnoženie počtu kópií danej rekombinantnej molekuly nastáva jej prirodzenou replikáciou v tomto organizme. Rekombinantná molekula je teda tvorená „naším” génom záujmu, ktorý sa pomocou restrikčných miest vkladá do nosičovej molekuly DNA, tzv. vektora. Vložený gén vo vektore sa nazýva inzert. Ak je funkciou vektora klonovanie, t.j. namnoženie počtu kópií nášho génu záujmu potrebné k ďalším analýzam, nazýva sa klonovací vektor.

Restrikčné endonukleázy alebo restrikázy sú enzýmy štiepiace DNA v presne definovaných cieľových sekvenciách, tzv. restrikčných miestach. Tie predstavujú zväčša palindromatické sekvencie DNA s párnym počtom rozpoznávacích nukleotidov (4, 6, príp. viac). Palindróm je nukleotidová sekvencia, ktorá sa na komplementárnom vlákne opakuje v presne obrátenom/protismernom poradí nukleotidov. Symetria rozoznávacej sekvencie (palindróm) je spôsobená skutočnosťou, že restrikčné endonukleázy sa viažu na DNA ako diméry. Rozonávacia sekvencia môže byť jednoznačná (identita všetkých nukleotidov je presne určená) alebo nejednoznačná (v niektorých polohách môžu byť rôzne nukleotidy, napr. GT(A/C)(G/T)AC. V iných prípadoch je palindomatická rozoznávacia sekvencia prerušená niekoľkými náhodnými nukleotidmi (N).

Pravdepodobnosť výskytu restrikčného miesta na DNA je štatistická, pričom väčšia je v prípade restrikčných enzýmov rozoznávajúcich 4- ako 6-nukleotidové restrikčné miesta. Restrikčný enzým s názvom EcoRI (izolovaný z Escherichia coli) rozoznáva palindromatickú sekvenciu 5'-GAATTC-3'. Na určitom mieste na DNA môže byť ľubovoľný jeden zo štyroch nukleotidov (A, T, G alebo C). To znamená, že pravdepodobnosť výskytu sekvencie GAATTC (o dĺžke 6 nukleotidov) na DNA je daná číslom 4⁶ = 4096, z čoho vyplýva, že v priemere (!) každé 4 kbp sa nachádza rozpoznávacia sekvencia pre EcoRI. Enzým HhaI (izolovaný z Haemophilus haemolyticus), ktorý rozoznáva 4-nukleotidovú sekvenciu, má restrikčné miesta v priemere každých 256 nukleotidov (4⁴). Existuje mnoho komerčne dostupných restrikčných endonukleáz. Vektory sa však často cielene dizajnujú tak, aby obsahovali restrikčné miesta pre najpoužívanejšie enzýmy (EcoRI, HindIII, SacI, BamHI, PstI, KpnI) nahustené za sebou v krátkej oblasti označovanej ako polylinker (alebo z angl. MCS − multi-cloning site).

Pod pojmom klonovanie DNA sa rozumie vytváranie mnohých kópií špecifických sekvencií DNA za účelom ďalšieho molekulárno-biologického výskumu (expresia génu a jej regulácia; sekvenovanie − tzn. určovanie primárnej štruktúry, poradia nukleotidov; cielená mutagenéza − tvorba mutácií a štúdium mutantného fenotypu). Klonovanie DNA v zmysle molekulárnej biológie je teda odlišné od klonovania celých organizmov (napr. ovca Dolly).

Klonovanie DNA tak pozostáva z nasledovných krokov:

1. Izolácia DNA z organizmu, ktorého genetickú informáciu chceme študovať.
2. Príprava klonovacieho vektora (biotechnologické firmy zväčša dodávajú hotové vektory).
3. Štiepenie donorovej DNA a vektora pomocou restrikčných endonukleáz.
4. Ligácia fragmentov (inzertu) donorovej DNA s vektorom pomocou enzýmu ligázy (najviac sa používa ligáza z bakteriofágu T4, pomenovaná T4-ligáza).
5. Transformácia buniek ligačnou zmesou (obsahujúcou rekombinatné molekuly vektor + inzert).

Plazmidové vektory pre Escherichia coli

Plazmidy sú kovalentne uzavreté kruhové molekuly, ktoré sa replikujú nezávisle od delenia bakteriálneho chromozómu. Ich veľkosť je v rozmedzí 1−200 kbp. Menšie plazmidy (2−15 kbp) sa efektívnejšie vnášajú do hostiteľských buniek ako plazmidy väčšie. Taktiež menšia DNA je stabilnejšia a spravidla sa v hostiteľovi replikuje do vyššieho počtu. Veľké plazmidy sú často len jednokópiové (napr. F plazmid). Plazmidové klonovacie vektory sa vnášajú do buniek pomocou transformácie.

Plazmidový klonovací vektor pre E. coli musí mať tieto sekvencie:

• Počiatok replikácie (ori, angl. origin = pôvod, začiatok)
• Restrikčné miesto pre restrikčné endonukleázy na vloženie cudzieho DNA fragmentu (polylinker)
• Selekčný marker (napr. gén rezistencie na antibiotiká)

Transformácia baktérií: Metódy a príprava kompetentných buniek

Transformácia je proces, pri ktorom dochádza k zavedeniu cudzej molekuly DNA (novej genetickej informácie) do buniek, a tým bunky získajú nové fenotypové vlastnosti. Transformovať je možné veľké množstvo organizmov vrátane baktérií, kvasiniek, rastlinných a živočíšnych buniek. Do buniek je možné novú DNA vniesť niekoľkými spôsobmi, ktorými sú:

• Transformácia (v užšom zmysle slova) je proces, pri ktorom sa do buniek vnesie plazmidová DNA priamo z roztoku (napr. z ligačnej zmesi).
• Transdukcia je spôsob prenosu DNA pomocou vírusov. Rekombinantné bakteriofágy je možné využiť ako vektory na prenos cudzorodej DNA do buniek baktérií.
• Transfekcia (spojenie slov transformácia + infekcia), pri ktorej sa transfomuje bunka purifikovanou rekombinantnou vírusovou alebo fágovou DNA (t.j. nie pomocou viriónov), pričom po úspešnej transfekcii sa obnoví virulencia (vytvoria sa plne funkčné vírusové častice).

Na prenos rekombinantných DNA z jednej baktérie do druhej sa môže využiť prirodzený proces − konjugácia. Bunky, ktoré sú schopné prijať cudziu DNA, sa nazývajú kompetentné bunky. Niektoré druhy baktérií (napr. Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae) sú prirodzene kompetentné v niektorých fázach svojho životného cyklu. U iných druhov (napr. Escherichia coli) je možné pripraviť kompetentné bunky opracovaním špeciálnymi roztokmi, príp. sa cudzorodá DNA vnáša pomocou elektrického poľa.

Účinnosť transformácie sa udáva v počte rekombinantov vzniknutých z 1 µg DNA a vyjadruje sa ako jednotka CFU/µg (angl. colony forming unit per microgram). Základnú metódu na prípravu kompetentných buniek Escherichia coli vyvinuli Mandel a Higa v roku 1970. Princípom metódy je príprava kompetentných buniek opracovaním ľadovým chloridom vápenatým (CaCl₂), čím sa zmení štruktúra a náboj bunkovej steny. Po inkubácii kompetentných buniek s roztokom rekombinantnej DNA pri 0 °C sa bunky vystavia na krátku dobu (50 s) teplotnému šoku (angl. heat-shock) pri 42 °C, čím sa umožní vstup DNA do bunky. Následne sa bunky regenerujú inkubáciou v neselektívnom kultivačnom médiu, aby došlo k zaceleniu bunkovej steny a expresii génov rezistencie na rekombinantnom plazmide. Napokon sa bunky vysejú na selektívne médium s antibiotikom, kde narastú len kolónie rekombinantov, pričom bunky bez rekombinantného plazmidu zahynú vplyvom antibiotika. Efektívnosť transformácie nezávisí len od spôsobu opracovania E. coli ale aj od ich genotypu.

Elektroporácia je univerzálna metóda, ktorá sa používa na transformáciu rôznych druhov baktérií, kvasiniek, cicavčích buniek a iných. Pri tejto metóde sa bunky v prítomnosti DNA na krátku dobu vystavia pôsobeniu elektrického poľa s vysokým napätím (cca 10 kV/cm). Pri tomto procese dochádza k vytvoreniu pórov na povrchu a DNA vstupuje cez bunkovú membránu do vnútra buniek. Bunky sa potom regenerujú a vysievajú na selektívne médiá rovnako ako pri predchádzajúcom postupe. Pre každý typ buniek je možné vypracovať optimálny protokol, ktorý zahŕňa kultiváciu buniek v špeciálnych kultivačných médiách (napr. prítomnosť glycínu inhibuje syntézu bakteriálnej bunkovej steny, a tým zvyšuje účinnosť elektroporácie), vytipovanie optimálnej fázy rastu a správne nastavenie elektroporačného napätia a času. Pri príprave buniek na elektroporáciu je kritické odstránenie iónov z povrchu bakteriálnych buniek, aby sa zabránilo elektrickému výboju.

Selekcia rekombinantov: Modro-biely skríning

Už pri výbere rekombinantného vektora sa snažíme o to, aby bolo možné jednoducho odlíšiť úspešne transformované bakteriálne kolónie od netransformovaných kolónií, príp. aj kolónií transformovaných „prázdnym” vektorom, tzn. vektorom bez inzertu. V ďalšom kroku je vhodné odlíšiť kolónie nesúce „prázdny” vektor a rekombinantný vektor s inzertom, čím sa mnohonásobne zvyšuje šanca, že si pre ďalšie analýzy vyberieme správny klon, ktorý nás zaujíma. To sa v prípade baktérií zabezpečuje najčastejšie tak, že restrikčné miesto, resp. polylinker tvorí súčasť génu pre enzým β-galaktozidázu (lacZ). Selekcia rekombinantov založená na využití tohto enzýmu sa nazýva modro-biely skríning a názov má odvodený od dvoch farebne odlíšených typov kolónií, ktoré rastú na selektívnom agarovom médiu.

Vektor v skutočnosti neobsahuje celý gén pre β-galaktozidázu. Využíva sa fakt, že tento enzým možno „rozdeliť” na dva peptidy (nefunkčné jeden bez druhého), ktoré, ak sú naraz prítomné v bunke, spontánne sa k sebe viažu a vytvárajú funkčnú β-galaktozidázu. Tento jav sa nazýva α-komplementácia β-galaktozidázy. Dlhší z týchto peptidov − LacZΩ − je kódovaný bakteriálnym chromozómom a kratší − LacZα − je kódovaný vektorom, pričom je prerušený spomínanou krátkou sekvenciou polylinkera, kam sa klonuje náš inzert.

Po restrikčnom štiepení vektora, tzn. jeho otvorení restrikčným enzýmom v mieste polylinkera, a jeho zmiešaní s fragmentom klonovaného génu (inzertom) s komplementárnymi koncami v ligačnej zmesi môžu nastať dva prípady. Ak sa inzert včlení do vektora, zásadne tým poruší čítací rámec génu lacZ, výsledkom čoho je nefunkčná β-galaktozidáza. Ak sa inzert do vektora nevčlení, dôjde k spätnému „zatvoreniu” (recirkularizácii) vektora, čítací rámec lacZ ostáva neporušený a bunka disponuje funkčným enzýmom β-galaktozidázy.

Modro-biely skríning teda využíva enzymatickú aktivitu enzýmu β-galaktozidázy. Na selektívne agarové médium sa pridajú roztoky dvoch chemických látok: IPTG a X-gal. IPTG (izopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranozid) je syntetický derivát laktózy, ktorý je, podobne ako laktóza, induktorom expresie β-galaktozidázy. Na rozdiel od laktózy ho však bunka nevie metabolizovať na glukózu, čo spôsobí permanentnú expresiu β-galaktozidázy (keby sa použil ako induktor laktóza, časom dôjde ku katabolickej represii). X-gal je zas iná syntetická zlúčenina, ktorá sa účinkom β-galaktozidázy rozkladá na produkt farbiaci kolóniu do modra.

Vektor obsahuje ako selekčný marker gén rezistencie na ampicilín a čítací rámec lacZ, do ktorého je vložený polylinker. Vektorovú molekulu aj molekulu donorovej DNA (cudziu DNA, ktorú chceme klonovať) štiepime osobitne pomocou jedného restrikčného enzýmu (napr. EcoRI), výsledné fragmenty zmiešame a transformujeme nimi baktérie E. coli s nefunkčným enzýmom β-galaktozidázou. Bunky vysievame na médium obsahujúce ampicilín, IPTG a X-gal. Tie, ktoré neboli transformované vektorom, postrádajú gén rezistencie na ampicilín, takže na médiu nevyrastú. Bunky s prázdnym vektorom vyrastú a v dôsledku funkčného enzýmu β-galaktozidázy štiepia X-gal na modrú zlúčeninu.

Asymetrické klonovanie a potvrdenie inzertov

Účelom asymetrického klonovania je zabránenie spontánnej recirkularizácii vektora, a tým zvýšenie pravdepodobnosti vzniku rekombinantných molekúl vektor + inzert. Asymetrické klonovanie využíva štiepenie donorovej a vektorovej DNA dvoma restrikčnými enzýmami, ktoré produkujú sekvenčne rozdielne konce. Takéto konce nie sú k sebe komplementárne, a tak nemôže dôjsť k recirkularizácii vektorovej molekuly. Keďže schopnosť transformácie majú len cirkulárne a nie lineárne rekombinantné vektory, je vysoko pravdepodobné, že kolónie, ktoré vyrastú na selektívnom antibiotikovom médiu, obsahujú rekombinantný vektor práve s vloženým inzertom. Asymetrickým klonovaním sa zároveň zabezpečuje vloženie inzertu v správnej orientácii, ktorá môže byť dôležitá pre niektoré experimenty.

Napriek tomu, že došlo k selekcii rekombinantov na médiu s antibiotikom a po modro-bielom skríningu sme selektovali biele kolónie, môžu sa inzerty v rekombinantných vektoroch z rôznych bunkových klonov odlišovať. Na potvrdenie správnej sekvencie inzertu alebo identifikáciu neznámych inzertov v rekombinantných plazmidoch existujú rôzne techniky ich analýzy. Sú to teda rôzne metódy na hľadanie konkrétnych sekvencií DNA (génov) spomedzi viacerých klonov (bunkových kolónií), ktoré nesú rôzne rekombinantné molekuly DNA.

Izolácia DNA z E. coli: Metódy lýzy buniek

Izolace plasmidové DNA je v mikrobiologii důležitou a často využívanou metodou. Samotné izolaci předchází příprava bakteriálních kompetentních buněk a amplifikace plasmidů. V této práci jsou plasmidy CHR2, ASAP1, ASAP-3, ASAP-5 a Kir2.1. nejprve amplifikovány v bakteriích E.Coli kmenu DH5 a poté metodou fenol-chloroformové extrakce izolovány. K určení správnosti izolace slouží gelová elektroforéza a transfekce do buněčné linie HEK293. Elektroforetické analýzy genómovej DNA E. coli EDL933 podrobené 0 - 15 minútovej ultrazvukovej analýze.

Ultrazvuková lýza buniek E. coli

Ultrazvukové disruptory buniek poskytujú spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky lýzy E. coli. Intenzívne, ale presne kontrolovateľné kavitačné a šmykové sily vedú k úplnému narušeniu a vysokým výťažkom extrakcie (napr. proteíny, DNA). Prečo je ultrazvukové narušenie buniek E. coli preferovanou metódou? Ultrazvukové homogenizátory alebo ultrazvukové sondy ponúkajú niekoľko výhod pri lýze E. coli, pretože intenzívny ultrazvuk účinne narúša bunkové steny a membrány. Ultrazvukové prístroje sondového typu sú široko používané na lýzu E. coli.

Medzi kľúčové výhody patria:

• Efektívne narušenie bunkových stien: E. coli má polotuhú bunkovú stenu zloženú z peptidoglykánu, ktorý môže byť ťažké rozbiť pomocou tradičných metód lýzy. Ultrazvukový prístroj typu sondy generuje intenzívne ultrazvukové vlny, ktoré vytvárajú kavitačné bubliny v kvapaline obklopujúcej bunky. Homogenizátory ultrazvukového sondového typu pracujú s cca. 20 000 cyklov za sekundu (pri 20 kHz) a spôsobujú kavitáciu v kvapalinách alebo suspenziách. Akustická kavitácia: mikroskopické oblasti tlakov podobných vákuu a vysokých teplôt, ktoré roztrhávajú bunky. Ultrazvukom generovaná akustická kavitácia a šmykové sily perforujú alebo rozbíjajú bunkovú membránu bakteriálnych buniek, ako je E.coli.
• Vylepšená penetrácia: Ultrazvukové vlny generované sondou / sonotródou môžu preniknúť hlboko do vzorky, dosiahnuť väčší počet buniek E. coli a rovnomerne ich ošetriť.
• Skrátený čas spracovania: Energia dodávaná ultrazvukom typu sondy je vysoko koncentrovaná a lokalizovaná, čo vedie k rýchlej a efektívnej lýze buniek. V porovnaní s inými metódami, ako je šľahanie guľôčok alebo enzymatická lýza, môže sonikácia dosiahnuť lýzu E. coli v priebehu niekoľkých minút alebo dokonca sekúnd. Zatiaľ čo mnohé alternatívne techniky, ako je zmrazovanie a rozmrazovanie, vyžadujú niekoľko kol liečby, ultrazvuková lýza otvára bunky v jednom kroku procesu.
• Regulácia teploty: Najmodernejšie ultrazvukové prístroje sú vybavené teplotnými senzormi a inteligentným softvérom, ktorý umožňuje nastaviť maximálnu procesnú teplotu. Ultrazvuk sa automaticky pozastaví, keď sa dosiahne teplotný limit, a spustí proces sonikácie, keď sa dosiahne nastavený teplotný bod.
• Škálovateľnosť: Ultrazvukové prístroje sondového typu sú k dispozícii v rôznych veľkostiach, od ručných zariadení až po veľké priemyselné modely. Vďaka tomu sú vhodné na spracovanie malých objemov v laboratóriu alebo na rozšírenie pre väčšie aplikácie biologického spracovania.
• Univerzálnosť: Ultrazvukové prístroje možno použiť na rôzne aplikácie okrem lýzy buniek, ako je strihanie DNA, extrakcia proteínov, homogenizácia tkanív, disperzia nanočastíc a emulgácia.

Ultrazvuková lýza je založená iba na mechanických silách. Nie sú pridané žiadne chemikálie, sonikácia rozbíja bunkovú stenu šmykovými silami. Chemická lýza môže zmeniť štruktúru bielkovín a spôsobiť problémy s čistením. Enzymatické narušenie vyžaduje dlhé inkubačné časy a nie je reprodukovateľné. Ultrazvukové narušenie buniek baktérií E. coli je rýchle, jednoduché, spoľahlivé a reprodukovateľné. Sonikácia je najobľúbenejšou technikou na lýzu veľmi malých, stredných a veľkých množstiev bunkových suspenzií - od pikolitrov do 100 l/h (pomocou ultrazvukovej prietokovej cely). Bunky sa lyzujú šmykom kvapaliny a kavitáciou. Aj keď teploty môžu dosiahnuť niekoľko tisíc stupňov Celzia, kavitačné objemy sú také malé, že proces výrazne nezohrievajú.

Regulácia teploty počas ultrazvukovej lýzy E. coli je kritická. V ideálnom prípade by sa vzorky mali počas lýzy udržiavať ľadovo studené, ale pre väčšinu vzoriek stačí, ak teplota nestúpne nad teplotu kultúry alebo zdroja tkaniva. Preto sa odporúča ponechať suspenziu na ľade a sonikovať niekoľkými krátkymi ultrazvukovými impulzmi 5-10 sekúnd a pauzami 10-30 sekúnd. Počas prestávok sa teplo môže rozptýliť, aby sa obnovila nízka teplota. Ultrazvukové prístroje Hielscher umožňujú presnú kontrolu procesných parametrov, ako je intenzita ultrazvuku, amplitúda, príkon energie a teplota.

Príklady protokolov ultrazvukovej lýzy E. coli

Vedci používajú ultrazvukové homogenizátory Hielscher na narušenie buniek E. coli pre rôzne aplikácie. Nižšie sú uvedené testované a osvedčené protokoly:

Spoločnosť Hielscher Ultrasonics navrhuje, vyrába a dodáva vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory na spoľahlivú a efektívnu lýzu baktérií E. coli. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe svojou najvyššou kvalitou a dizajnovými štandardmi. Inteligentný softvér, intuitívne menu, programovateľné nastavenia a automatické protokolovanie údajov sú len niektoré z funkcií ultrazvukových prístrojov Hielscher. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémovú integráciu našich ultrazvukových zariadení do výskumných a biotechnologických zariadení. Aj drsné podmienky a náročné prostredie ľahko zvládnu ultrazvukové prístroje Hielscher. Hielscher Ultrasonics je spoločnosť s certifikáciou ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a užívateľskou prívetivosťou. Video ukazuje ultrazvukový systém prípravy vzoriek UIP400MTP, ktorý umožňuje spoľahlivú prípravu vzoriek akýchkoľvek štandardných viacjamkových platničiek pomocou ultrazvuku s vysokou intenzitou.

Escherichia coli v biotechnológiách a medicíne

Escherichia coli (E. coli) je gramnegatívna, fakultatívne anaeróbna, tyčinkovitá koliformná baktéria rodu Escherichia, ktorá sa bežne vyskytuje v dolnom čreve teplokrvných organizmov (endotermy). Existuje veľké množstvo kmeňov E. coli (alebo podtypov) s rôznymi vlastnosťami. Väčšina kmeňov E. coli je pre človeka neškodná, napr. kmene B a K-12, ktoré sa bežne používajú na výskumné aplikácie v laboratóriách. E. coli hrá dôležitú úlohu v modernom biologickom inžinierstve a priemyselnej mikrobiológii, pretože s baktériami sa dá ľahko manipulovať. Bežné laboratórne aplikácie, ktoré často zahŕňajú použitie E. coli, napr. izolácia DNA.

E. coli je veľmi všestranný hostiteľ na produkciu heterológnych proteínov a na produkciu rekombinantných proteínov v E. coli sú k dispozícii rôzne expresné systémy proteínov. E. coli sa používajú ako bunkové továrne na výrobu inzulínu. Ďalšie aplikácie zahŕňajú použitie modifikovaných buniek E. coli. Kmeň K-12 je mutantná forma E. coli, ktorá nadmerne exprimuje enzým alkalickú fosfatázu (ALP). K tejto mutácii dochádza v dôsledku defektu génu, ktorý neustále kóduje enzým. Ak gén produkuje produkt bez akejkoľvek inhibície, je to známe ako konštitutívna aktivita. Baktérie E. coli sú tiež široko používané ako bunkové továrne. Umelo vytvorené mikróby (napr. baktérie) a rastlinné bunky možno použiť ako takzvané bunkové továrne. Tieto geneticky modifikované bunky produkujú molekuly, chemikálie, polyméry, proteíny a ďalšie látky, ktoré sa používajú napríklad vo farmaceutickom, potravinárskom a chemickom priemysle.

Medzinárodný tím kompletne dekódoval genetický materiál (genóm) bakteriálneho kmeňa E. coli O104:H4, ktorý spôsobuje nebezpečné vnútorné krvácanie a vyžiadal si desiatky obetí, najmä v Nemecku. Oznámili to vedci z BGI (Beijing Genomics Institute) v Šen-čene (Čína) a University Medical Centre Hamburg-Eppendorf (Nemecko). E. coli O104:H4 má jeden kruhový chromozóm s dĺžkou 5278 kbp (1 kbp = tisíc bázových párov čiže „písmen“ DNA) a tri dodatočné menšie útvary DNA, tzv. plazmidy, dlhé 88 kbp, 75 kbp a 1,5 kbp. Chromozóm obsahuje približne 5000 kódovacích sekvencií, čo zodpovedá čosi vyše 87 percentám genómu baktérie. Najväčší plazmid nesie viacero génov odolnosti proti liekom, najmenší iba dva gény, z ktorých jeden súvisi s kopírovaním DNA a druhý sa podľa všetkého podieľa - cez podporu zhromažďovania baktérií a posilnenie ich virulencie čiže choroboplodnosti - na pretrvávaní nákazy. Za nebezpečnosťou nákazy sú zväčša gény, ktoré kódujú toxíny Shiga (v angl. prepise), pomenované po japonskom bakteriológovi Kijošiovi Šigaovi (1875-1957). Baktéria E. coli O104:H4 ich podľa všetkého získala integráciou genetického materiálu vírusu. V jej genóme je viacero stôp takého zahrnutia cudzieho genetického materiálu, vrátane spomenutých génov odolnosti voči antibiotikám. Poukazuje to na fakt, že v pozadí virulencie tohto kmeňa je tzv. horizontálny prenos génov medzi rôznymi druhmi mikróbov. Analýza genómu ukázala, že kmeň patrí k enteroagregatívnym (zhlukujúcim sa v tráviacej sústave) baktériám E. coli označovaným ako EAEC, ktoré získali toxín Shiga zahrnutím genómu vírusu. Vysvetľuje to počiatočnú záhadu, ako môže mať EAEC isté vlastnosti enterohemoragickej (spôsobujúcej krvácanie v tráviacej sústave) E. coli čiže EHEC. Smrtonosná nemecká E. coli teda nie je celkom nová baktéria, ale akýsi „hybridný“ kmeň, ktorý vedci dočasne označili ako STpEAEC (Shiga toxin-producing enteroaggregative Escherichia coli, enteroagregatívna E. coli, ktorá produkuje toxín Shiga).

Nové metódy transformácie baktérií

Testovanie transformácie baktérií E. coli je kľúčové. Transformácia baktérií pomocou vpravovania špecifického DNA plazmidu je bežne používanou metódou. Využitie našla v mnohých odvetviach výskumu, od molekulárnej biológie až po mikrobiologické a genetické inžinierstvo. Baktérie sú veľmi prispôsobivé organizmy, ktoré majú schopnosť pohltiť molekuly DNA, replikovať ich, ale taktiež ich využiť na syntézu špecifických proteínov. Jednu z nových metód používaných na transformáciu baktérií predstavuje použitie nerovnovážnej (nízkoteplotnej) plazmy. Cieľom práce bolo otestovať transformáciu bakteriálneho kmeňa E. coli DH5α v roztoku CaCl2 za použitia nízkoteplotnej plazmy generovanej kladným korónovým výbojom, ktorý ako pracovný plyn používa obyčajný vzduch pri atmosférickom tlaku. Dĺžka pôsobenia výboja bolo nastavená tak, aby nenastala úplná inaktivácia buniek. Do baktérií bol vpravovaný DNA plazmid pcDNA3.1. Účinnosť transformácie sme porovnávali s bežne používanou transformáciou tepelným šokom.

tags: #izolacia #dna #z #escherichia #coli