Komplexný Sprievodca Izoláciou DNA a Purifikáciou Nukleových Kyselín

Izolácia nukleových kyselín je prvým krokom v mnohých experimentoch molekulárnej biológie. Ideálne je potrebné získať cieľovú nukleovú kyselinu (DNA alebo RNA) v dostatočnom množstve a kvalite, to je bez prímesí „nadbytočných” látok, tzv. kontaminantov. Kvalita templátovej DNA nicméně ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat. Nečistoty reakci zpomalují tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo tím, že se vážou na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerasové reakci.

Výber metódy izolácie záleží od spôsobu, akým sa bude nukleová kyselina v ďalšom postupe analyzovať. Napr. pri použití metódy PCR (polymerázová reťazová reakcia) postačujú malé množstvá DNA, ktorej čistota a integrita nie sú vo väčšine prípadov kritické. Na druhej strane, pri klonovaní, enzymatickom opracovaní DNA restrikčnými endonukleázami alebo pri sekvenovaní sú potrebné relatívne väčšie množstvá DNA s vyššou čistotou. Nukleové kyseliny je možné izolovať z rôznych zdrojov, vrátane extrémnych, ako je pôda, úžitková voda, potraviny a iné.

Lýza Buniek a Tkanív

Ak sa DNA izoluje z buniek (napr. z částečky tkáně, buněk bukální sliznice získaných stěrem, leukocytů periferní krve), je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Na izoláciu DNA je dôležité dôkladné rozrušenie pletív buniek a ich súčastí. Možno povedať, že bunky vyšších organizmov deštruujú ľahšie a jednoduchšie, naopak rastlinné bunky a pletivá a bunky mikroorganizmov sú rezistentnejšie a ich rozbíjaním sa môžu niekedy poškodiť i štruktúry niektorých druhov nukleových kyselín. Bunky sa obvykle rozrušujú v prostredí príslušného extrakčného činidla, ktoré má overenú iónovú silu, reakciu prostredia obsahuje inhibítory nukleáz a pod.

V prípade, že sa bunková kultúra pestuje v tekutom médiu, je prvým krokom izolácie oddelenie buniek od média centrifugáciou. Aby došlo k uvoľneniu nukleovej kyseliny do vodného roztoku, je potrebné rozrušiť (dezintegrovať) bunkové steny a biomembrány.

Metódy lýzy

• Mechanické metódy

  Jedným z najviac používaných postupov deštrukcie rastlinných buniek a pletív je mechanické rozdrvenie materiálu, ktoré však niekedy môže zapríčiniť i čiastočnú degradáciu nukleových kyselín. Výhodnejším môže byť zmrazenie rastlinného materiálu v kvapalnom dusíku s nasledujúcim rozdrvením na prášok a extrakciou v mixéri alebo v sklenenom homogenizátore. V prípade izolácie nukleových kyselín zo živočíšnych tkanív a celých orgánov (myšacia slezina, pečeň, mozog) je potrebná homogenizácia vstupného materiálu. K tomuto účelu je možné použiť mechanické rozdrvenie v homogenizátore alebo rozrušenie bunkovej hmoty zmrazením v tekutom dusíku. Nevzácne je treba okrem chemickej lýzy použiť aj mechanickú lýzu bakteriálnych buniek pomocou ultrasonikátora, ktorý na disrupciu buniek využíva ultrazvukové vlny.

• Enzymatické metódy

  Na lýzu bakteriálnych buniek sa najčastejšie používa enzymatické opracovanie bunkovej steny lyzozýmom, ktorý hydrolyzuje glykozidické väzby v peptidoglykánoch. Tento enzým sa prirodzene vyskytuje vo vaječnom bielku (zdroj na izoláciu) a v slzách. Na uvoľnenie obsahu rastlinných buniek obalených bunkovou stenou sa používa v prvom kroku mechanické ako aj enzymatické opracovanie (celulázy). K rozpadu bunkových štruktúr prispieva degradácia proteínov pomocou enzýmov proteáz, napr. proteinázy K.

• Chemické metódy

  Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů. Druhým krokom je rozrušenie cytoplazmatickej membrány bakteriálnej bunky pôsobením ionogénnych detergentov (detergentov tvoriacich ióny), napr. SDS − dodecylsulfát sodný. Živočíšne bunky sú obalené len cytoplazmatickou membránou, a preto je možné dosiahnuť ich lýzu jemnejšími prostriedkami, napr. pôsobením slabých neionogénnych detergentov (napr. Triton X-100) v kombinácii s proteolytickými enzýmami (napr. proteinázou K).

  Dôležitým faktorom je aj prítomnosť chelatačných činidiel (napr. EDTA − kyselina etyléndiamíntetraoctová), ktoré z roztoku „vychytávajú” dvojmocné katióny (Mg²⁺, Ca²⁺), čím inaktivujú bunkové DNázy. Neprítomnosť dvojmocných katiónov zároveň destabilizuje vonkajšiu bakteriálnu membránu.

Pri lýze sa uvoľní celý obsah buniek do roztoku, pričom vznikne komplexná zmes obsahujúca zvyšky bunkových stien a bunkových membrán, proteíny, nukleové kyseliny, polysacharidy a rôzne nízkomolekulové zložky (obzvlášť dôležité pri izolácii z rastlinných buniek kvôli prítomnosti chemických zlúčenín vakuolárnej šťavy). Aby nedochádzalo k degradácii izolovanej nukleovej kyseliny je potrebné použiť čo najmiernejšie podmienky lýzy, t.j. uskutočňovať ju v tlmivom roztoku a v chlade. Zdrojom nukleových kyselín môžu byť aj subcelulárne častice - organely alebo vírusy, ktoré získame po izolácii centrifugáciou v hustotnom gradiente. Ten pozostáva zo starostlivo namiešaného roztoku (najčastejšie sacharózy) s najväčšou koncentráciou naspodu, na ktorý postupne nalievame roztoky s nižšou koncentráciou, pričom pri pozornej príprave sa tieto roztoky nezmiešajú ale ostanú ako oddelené fázy. Pri centrifugácii bunkového materiálu v takomto hustotnom gradiente dochádza k zachytávaniu rôzne ťažkých sedimentov na určitom medzistupni/fáze.

Purifikácia Nukleových Kyselín z Lyzátu

Princípom purifikácie akéhokoľvek materiálu z buniek je cieľom zbaviť sa zložiek, ktoré pri ďalšej práci nepotrebujeme. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu. Pri izolácii nukleových kyselín je dôležité odstrániť zo zmesi proteíny, medzi ktoré patria aj bunkové nukleázy, ktoré môžu degradovať izolovanú nukleovú kyselinu, ako aj proteíny viažúce sa na DNA, ktoré svojou prítomnosťou môžu rušiť následné analýzy (napr. štiepenie restrikčnými endonukleázami).

Odstránenie proteínov a iných kontaminantov

Kontaminujúce bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží. Enzýmy proteázy, napríklad proteináza K, čiastočne hydrolyzujú kontaminujúce bielkoviny. Dôkladné prečistenie preparátov NK od bielkovinových prímesí sa dá uskutočniť viacerými postupmi, v ktorých použité činidlá denaturujú prítomné bielkoviny a NK zostávajú rozpustené vo vodnej fáze bez toho aby sa porušila ich štruktúra. Deproteinizačných prostriedkov sa na izoláciu NK používajú najčastejšie: fenol, chloroform, guanidinchlorid, chloristan sodný.

Organická extrakcia (Fenol-Chloroformová metóda)

Fenol-chloroformová technika je preto stále „zlatým štandardom“ purifikácie nukleových kyselín. Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Medzi výhody organickej extrakcie patrí vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistú DNA. Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Pri spracovaní velkého počtu vzorkov se obtížně automatizuje. Jeho veľkou nevýhodou je vysoká toxicita fenolu.

Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Tieto látky sú s vodou nemiešateľné, a preto sa po ich pridaní k vodnému roztoku nukleových kyselín vytvoria dve fázy. Pri premiešaní takejto zmesi dochádza na fázovom rozhraní k denaturácii proteínov. Pri pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstáva rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, ktorý usnadní oddělení fází a zabrání pěnění pri zpracovávaní vzorkov bohatých na proteiny. Vrstiev pri centrifugácii udržuje izoamylalkohol ich stabilitu. Ak sa roztok nukleových kyselín extrahuje fenolom s neutrálnym pH, nukleové kyseliny zostávajú po extrakcii vo vodnej fáze.

Po fenolovej extrakcii je dôležité zbaviť roztoky nukleových kyselín zvyškov fenolu, pretože fenol môže inhibovať následné enzymatické reakcie (napr. restrikčné štiepenie). Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, ktoré by interferovaly s navazujícími metodami.

Extrakcia na tuhej fáze (Silikátové a Magnetické guličky)

Po odstránení kontaminujúcich bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná převážně nízkomolekulárními látkami. Využívá se křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci.

Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).

Odstránenie polysacharidov a RNA

Preparáty NK pripravené základnými izolačnými postupmi obvykle nepredstavujú homogénne poulácie. Nejde tu len o zmesi jednotlivých druhov NK, ale často i o prímes iných interferujúcich látok, najmä polysacharidov a ďalších iných fosfátových esterov. Oddelenie NK a polysacharidov možno urobiť pomocou cetyltrimetylamoniumbromidu (CTA). Pomocou neho možno oddeliť oba druhy NK, pričom polysacharidy a väčšina ďalších fosfátových esterov zostáva v roztoku. CTA - soli NK sa odcentrifugujú, opakovane sa premyjú 70% etanolom a etyléterom a nakoniec sa dosušia vo vákuu.

Prečistenie DNA od prímesí RNA sa môže robiť enzymaticky, izopropylalkoholom a fenolovou extrakciou. Enzymaticky sa DNA od RNA očisťuje pomocou špecifických ribonukleáz, ktoré degradujú RNA na oligoribonukleotidy. Deproteinovaný bunkový extrakt sa nechá inkubovať 30 minút pri 37 °C v prítomnosti pankreatickej ribonukleázy z ktorej sa musia pred samotným použitím odstrániť stopy deoxyribonukleázy. 0,2 % roztok kryštalickej pankreatickej ribonukleázy v 0,15 mol.dm-3 roztoku chloridu sodného s pH 5,0 sa predinkubuje 10 minút pri 80 °C. Preparát DNA sa po inkubácii s enzýmom precipituje etanolom, kým hydrolyticky uvoľnené oligoribonukleotidy zostávajú v roztoku. Na odstránenie RNA z preparátov DNA sa používa pankreatická RNáza. Tento enzým je veľmi stabilný a zároveň nevyžaduje pre svoju aktivitu dvojmocné ióny, čo neplatí napr. pre DNázy.

Zrážanie nukleových kyselín alkoholom

Na prečistenie nukleových kyselín od nízkomolekulových látok (soli, zvyšky fenolu) a na skoncentrovanie vzorky sa používa alkoholové zrážanie (najčastejšie čistým, bezvodým etanolom alebo izopropanolom). Následuje proto vysrážení DNA z roztoku např. jejím vysolením nebo pomocí jednoduchých alkoholů (etanolu nebo izopropanolu). Poté se DNA vysráží z vodného roztoku.

Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka (napr. etanol alebo izopropanol). Zrážanie sa robí v prítomnosti jednomocných iónov (napr. 0,1 M octan sodný) a pri nízkej teplote (-20 °C). V týchto podmienkach je výťažok kvantitatívny aj pri nízkej koncentrácii DNA. Na druhej strane, zrážanie pri laboratórnej teplote (+20 °C) je výhodné, ak chceme vyzrážať DNA bez súčasného vyzrážania („oživenia”) kontaminujúcej RNA. Vyzrážaná nukleová kyselina sa nazýva precipitát.

Precipitát DNA sa od roztoku oddelí vysokootáčkovou centrifugáciou. Premytím 70 % etanolom sa odstránia zvyšky solí prítomné v precipitáte a precipitát sa vysuší tak, aby sa odparili zvyšky etanolu, ale zároveň aby DNA zostala hydratovaná. Molekula DNA v kyslom prostredí môže spontánne degradovať, a preto sa DNA rozpúšťa v slabo zásaditom tlmivom roztoku s prídavkom EDTA (tzv. roztok TE).

Špecifiká Izolácie RNA

Pri izolácii RNA z akéhokoľvek biologického materiálu je hlavným problémom jej nestabilita. Molekula RNA podlieha degradácii oveľa ľahšie ako DNA a zároveň ribonukleázy sú vo všeobecnosti veľmi stabilné a všadeprítomné enzýmy, ktoré nepotrebujú k svojej aktivite ako kofaktory dvojmocné ióny, na rozdiel od DNáz. Vedeli ste, že...? RNáza sa skutočne vyskytuje všade. Vylučuje sa aj potnými žľazami na končekoch prstov, takže práca bez rukavíc je absolútne neprípustná.

Metódy izolácie a purifikácie RNA sú založené na rýchlej lýze buniek, ktorá efektívne neutralizuje prítomné nukleázy. Kontaminujúce bielkoviny sa odstraňujú fenolovou extrakciou v kyslom prostredí alebo na silikagélových kolónkach. Zvyšky chromozomálnej DNA je možné rozložiť pôsobením DNázy. Pri izolácii RNA je zas dôležitým krokom odstránenie prímesí genomickej DNA, čo zabezpečí pankreatická DNáza. Purifikovaná RNA sa využíva na prípravu komplementárnej DNA (cDNA), northernovu hybridizáciu, RT-PCR, alebo na in vitro transláciu.

Pri mnohých aplikáciách je výhodné použiť iba frakciu mRNA. V princípe, izolácia mRNA spočíva vo využití prirodzenej enzymatickej posttranskripčnej modifikácie eukaryotickej mRNA, a to je pridávanie poly(A)-chvostíka na 3'-koniec molekuly mRNA za pomoci enzýmu poly(A)-polymerázy. Oligo-dT nosiče sú jednoduché plôšky, na ktorých sú fixované jednovláknové molekuly so sekvenciou poly(T), a teda sú komplementárne k jednovláknovým mRNA s poly(A) koncami. Ak sa roztok s prítomnými mRNA naleje na tieto nosiče, v prostredí s vyššou iónovou silou (pridanie solí) dochádza k hybridizácii, a teda zachytávaniu mRNA na týchto nosičoch.

Izolácia Plazmidovej DNA

Táto metóda sa používa pri izolácii plazmidov z bakteriálnych buniek za súčasného odstránenia chromozomálnej DNA. Bakteriálne bunky sú lyzované v alkalickom prostredí (0,2 M NaOH) v prítomnosti detergentu (1 % SDS). Chromozomálna DNA je pri lýze fragmentovaná na lineárne molekuly, zatiaľ čo plazmidová DNA, ktorá má podstatne menšiu veľkosť, si zachová cirkulárnu formu.

Pri pH okolo 12, ktoré je v roztoku, dochádza k denaturácii DNA, t.j. vodíkové väzby medzi bázami sa uvoľnia a vznikajú jednovláknové molekuly. Po neutralizácii roztoku (octanom draselným) kruhová plazmidová DNA renaturuje do pôvodnej dvojvláknovej formy, ale lineárne molekuly chromozomálnej DNA nie sú schopné tak rýchlo renaturovať, a preto agregujú s inými zložkami lyzátu (bunkové steny a membrány, proteíny, SDS).

DNA môže byť purifikovaná zo zmesi makromolekúl ultracentrifugáciou za pomoci chloridu cézneho (CsCl) a etídium bromidu. DNA sa skoncentruje do úzkeho prúžku v strede gradiantu, pričom lineárna a cirkulárna (plazmidová) DNA majú inú hustotu, a preto je možné ich touto metódou navzájom oddeliť. Po centrifugácii sa vyberú frakcie obsahujúce DNA, etídium bromid sa odstráni extrakciou n-butanolom a DNA sa z roztoku získa etanolovou precipitáciou. Výsledkom tejto techniky je vysokomolekulárna DNA s vysokou čistotou.

Riešenie Problémov pri Izolácii DNA

tags: #izolacia #dna #lyza #buniek #purifikacia #nk