Metódy izolácie a purifikácie nukleových kyselín: Od princípov k praktickým aplikáciám

Izolácia nukleových kyselín je prvým krokom v mnohých experimentoch molekulárnej biológie. Ideálne je potrebné získať cieľovú nukleovú kyselinu (DNA alebo RNA) v dostatočnom množstve a kvalite, to je bez prímesí „nadbytočných” látok, tzv. kontaminantov. Nukleové kyseliny je možné izolovať z rôznych zdrojov. Môžu to byť bunky bukálnej sliznice získané sterom, leukocyty periférnej krvi, subcelulárne častice ako organely alebo vírusy, živočíšne tkanivá a celé orgány, rastlinné bunky, baktérie, alebo dokonca extrémne zdroje ako pôda, úžitková voda a potraviny.

Výber metódy izolácie záleží od spôsobu, akým sa bude nukleová kyselina v ďalšom postupe analyzovať. Napríklad, ak začína molekulárno-genetické vyšetrenie polymerázovou reťazovou reakciou (PCR), stačí niekedy ako vzorka veľmi malé množstvo DNA. Niekedy možno dokonca použiť priamo časť tkaniva alebo niekoľko buniek lyzovaných napríklad hydroxidom, tenzidmi alebo zmrazovaním a rozmrazovaním. Pri použití metódy PCR postačujú malé množstvá DNA, ktorej čistota a integrita nie sú vo väčšine prípadov kritické. Na druhej strane, pri klonovaní, enzymatickom opracovaní DNA reštrikčnými endonukleázami alebo pri sekvenovaní sú potrebné relatívne väčšie množstvá DNA s vyššou čistotou.

Všeobecné princípy izolácie DNA

Ak sa DNA izoluje z buniek (napríklad z čiastočky tkaniva), je obvykle prvým krokom homogenizácia tkaniva a lýza buniek. Aby došlo k uvoľneniu nukleovej kyseliny do vodného roztoku, je potrebné rozrušiť (dezintegrovať) bunkové steny a biomembrány. Buněčné a jaderné membrány sa obvykle rozpúšťajú účinkom tenzidov. V prípade niektorých baktérií, ktoré majú veľmi hrubú bunkovú stenu alebo tvoria veľa sekundárnych metabolitov, je výhodné izolovať DNA z buniek v logaritmickej fáze rastu, t.j. pri ich aktívnom hromadnom delení. Na lýzu bakteriálnych buniek sa najčastejšie používa enzymatické opracovanie bunkovej steny lyzozýmom, ktorý hydrolyzuje glykozidické väzby v peptidoglykánoch.

Druhým krokom pri lýze bakteriálnych buniek je rozrušenie cytoplazmatickej membrány pôsobením ionogénnych detergentov, napríklad SDS (dodecylsulfát sodný). Nevzácne je treba okrem chemickej lýzy použiť aj mechanickú lýzu bakteriálnych buniek pomocou ultrasonikátora, ktorý na disrupciu buniek využíva ultrazvukové vlny. Na uvoľnenie obsahu rastlinných buniek obalených bunkovou stenou sa používa v prvom kroku mechanické ako aj enzymatické opracovanie (celulázy). V prípade izolácie nukleových kyselín zo živočíšnych tkanív a celých orgánov je potrebná homogenizácia vstupného materiálu, napríklad mechanickým rozdrvením v homogenizátore alebo rozrušením bunkovej hmoty zmrazením v tekutom dusíku. Živočíšne bunky sú obalené len cytoplazmatickou membránou, a preto je možné dosiahnuť ich lýzu jemnejšími prostriedkami, napríklad pôsobením slabých neionogénnych detergentov (napríklad Triton X-100) v kombinácii s proteolytickými enzýmami.

K rozpadu bunkových štruktúr prispieva degradácia proteínov pomocou enzýmov proteáz, napríklad proteináza K. Dôležitým faktorom je aj prítomnosť chelatačných činidiel (napríklad EDTA - kyselina etyléndiamíntetraoctová), ktoré z roztoku „vychytávajú” dvojmocné katióny (Mg²⁺, Ca²⁺), čím inaktivujú bunkové DNázy. Neprítomnosť dvojmocných katiónov zároveň destabilizuje vonkajšiu bakteriálnu membránu. Pri lýze sa uvoľní celý obsah buniek do roztoku, pričom vznikne komplexná zmes obsahujúca zvyšky bunkových stien a bunkových membrán, proteíny, nukleové kyseliny, polysacharidy a rôzne nízkomolekulové zložky. Aby nedochádzalo k degradácii izolovanej nukleovej kyseliny, je potrebné použiť čo najmiernejšie podmienky lýzy, t.j. uskutočňovať ju v tlmivom roztoku a v chlade.

Odstránenie kontaminantov

Princípom purifikácie akéhokoľvek materiálu z buniek je cieľom zbaviť sa zložiek, ktoré pri ďalšej práci nepotrebujeme. Vzniknutý lyzát obsahuje okrem DNA rad kontaminujúcich látok - všetky nízkomolekulárne i vysokomolekulárne súčasti tkaniva alebo buniek. Následuje preto extrakcia a purifikácia DNA z lyzátu. Kvalita templátovej DNA ovplyvňuje účinnosť amplifikácie v priebehu PCR a nečistoty obsiahnuté vo vzorke môžu polymerázovú reakciu výrazne spomaľovať. Nečistoty reakciu spomaľujú tým, že pôsobia ako inhibítory polymerázy, alebo tým, že sa viažu na templátovú DNA a zneprístupňujú ju tak polymerázovej reakcii.

Odstránenie proteínov

Pri izolácii nukleových kyselín je dôležité odstrániť zo zmesi proteíny, medzi ktoré patria aj bunkové nukleázy, ktoré môžu degradovať izolovanú nukleovú kyselinu, ako aj proteíny viažúce sa na DNA, ktoré svojou prítomnosťou môžu rušiť následné analýzy (napríklad štiepenie reštrikčnými endonukleázami). Kontaminujúce bielkoviny sa hydrolyzujú proteázami a/alebo denaturujú a vysrážajú. Najčastejšie používaným denaturačným a precipitačným činidlom býva fenol. Vysrážané bielkoviny sa potom oddelia vytrepaním do chloroformu a centrifugáciou. Pritom sa súčasne odstránia aj hydrofóbne súčasti zmesi. Po odstránení kontaminujúcich bielkovín a lipidov je DNA stále znečistená prevažne nízkomolekulárnymi látkami.

Odstránenie RNA

Na odstránenie RNA z preparátov DNA sa používa pankreatická RNáza. Tento enzým je veľmi stabilný a zároveň nevyžaduje pre svoju aktivitu dvojmocné ióny, čo neplatí napríklad pre DNázy. Pri izolácii RNA je zas dôležitým krokom odstránenie prímesí genomickej DNA, čo zabezpečí pankreatická DNáza.

Zrážanie a rozpúšťanie DNA

Následuje vysrážanie DNA z roztoku, napríklad jej vysolením alebo pomocou jednoduchých alkoholov (etanolu alebo izopropanolu). Na prečistenie nukleových kyselín od nízkomolekulových látok (soli, zvyšky fenolu) a na skoncentrovanie vzorky sa používa alkoholové zrážanie (najčastejšie čistým, bezvodým etanolom alebo izopropanolom). Zrážanie sa robí v prítomnosti jednomocných iónov (napríklad 0,1 M octan sodný) a pri nízkej teplote (-20 °C). V týchto podmienkach je výťažok kvantitatívny aj pri nízkej koncentrácii DNA. Na druhej strane, zrážanie pri laboratórnej teplote (+20 °C) je výhodné, ak chceme vyzrážať DNA bez súčasného vyzrážania („oživenia”) kontaminujúcej RNA.

Vyzrážaná nukleová kyselina sa nazýva precipitát. Precipitát DNA sa od roztoku oddelí vysokootáčkovou centrifugáciou. Premytím 70 % etanolom sa odstránia zvyšky solí prítomné v precipitáte a precipitát sa vysuší tak, aby sa odparili zvyšky etanolu, ale zároveň aby DNA zostala hydratovaná. Izolovaná a prečistená DNA sa potom spravidla rozpúšťa v alkalickom pufri, ktorý obsahuje etyléndiaminotetraoctovú kyselinu (EDTA). Molekula DNA v kyslom prostredí môže spontánne degradovať, a preto sa DNA rozpúšťa v slabo zásaditom tlmivom roztoku s prídavkom EDTA (tzv. roztok TE).

Klasické metódy izolácie DNA

Organická extrakcia: Fenol-chloroformová metóda

Fenol-chloroformová metóda je najpoužívanejšou technikou organickej extrakcie DNA. Aj keď je náročnejšia na čas a pracuje sa pri nej s nebezpečnými chemikáliami, umožňuje dosiahnuť vysokých výťažkov a získať prakticky čistú DNA. Medzi výhody organickej extrakcie patrí vysoký výťažok a vysoká čistota purifikovanej DNA. Fenol-chloroformová technika je preto stále „zlatým štandardom“ purifikácie nukleových kyselín.

Prvým krokom je homogenizácia tkaniva v pufri, ktorý obsahuje tenzid (napríklad dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí bunkové membrány. Rozpad buniek sa usnadňuje prídavkom proteinázy K. Tento účinný bakteriálny enzým, ktorý má teplotné optimum okolo 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani horečnaté ióny a ktorý neinhibujú ani koncentrované tenzidy, čiastočne hydrolyzuje kontaminujúce bielkoviny.

Následuje denaturácia bielkovín a ich vysrážanie zmesou fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová zmes sa nemieša s vodou. Pri pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zostáva rozpustená vo vodnej fáze, zatiaľ čo proteíny sa denaturujú a vypadávajú do hydrofóbnej fázy. Na odstránenie proteínov z preparátov nukleových kyselín sa často používa extrakcia organickými rozpúšťadlami (fenol, chloroform = trichlórmetán). Tieto látky sú s vodou nemiešateľné, a preto sa po ich pridaní k vodnému roztoku nukleových kyselín vytvoria dve fázy. Pri premiešaní takejto zmesi dochádza na fázovom rozhraní k denaturácii proteínov. Ak sa roztok nukleových kyselín extrahuje fenolom s neutrálnym pH, nukleové kyseliny zostávajú po extrakcii vo vodnej fáze.

Ku zmesi sa pridáva malé množstvo izoamylalkoholu, ktorý usnadní oddelenie fáz a zabráni peneniu pri spracovávaní vzoriek bohatých na proteíny. Potom sa DNA vysráža z vodného roztoku. Najprv sa pridá vo veľkej koncentrácii vhodná soľ (chlorid sodný, octan sodný a pod.). Jej ióny si vytvárajú hydratačný obal, čím odejmú DNA rozpúšťadlo (tzv. vysolovanie). Vysrážaná DNA sa premýva v 70% etanole. Po fenolovej extrakcii je dôležité zbaviť roztoky nukleových kyselín zvyškov fenolu, pretože fenol môže inhibovať následné enzymatické reakcie (napríklad reštrikčné štiepenie). Je tiež potrebné zaistiť, aby v záveru extrakcie boli spoľahlivo odstránené zbytky fenolu a chloroformu, ktoré by interferovali s nadväzujúcimi metódami. Táto metóda je časovo náročná a pracuje sa pri nej s nebezpečnými chemikáliami. Pri spracovaní veľkého počtu vzoriek sa obtiažne automatizuje.

Moderné prístupy k izolácii nukleových kyselín

Izolácia na báze pevnej fázy (Kolónová izolácia)

Extrakcia pomocou silikátovej pevnej fázy je relatívne jednoduchá a hodí sa aj pre automatizáciu. Využíva sa kremičitých guličiek s veľkým povrchom, ktorými je napríklad naplnená krátka chromatografická kolónka. Vo vodných roztokoch je povrch silikátu hydratovaný. Prídavkom vysokej koncentrácie tzv. chaotropných solí pri vhodnom pH dôjde k rozbitiu vodíkových mostíkov medzi molekulami vody a povrchom silikátu. Na takto dehydrovaný silikát sa svojimi fosfátovými skupinami s vysokou afinitou viaže DNA. Kontaminujúce látky je potom možné odmyť. Táto metóda je špecifická a jednoduchá technika pre izoláciu DNA.

Magnetická separácia

Pri magnetickej separácii sa DNA reverzibilne viaže na magnetické guličky potiahnuté vhodným povrchom - protilátkami proti DNA, silikátom, iónomeničom alebo povrchom s inými vhodnými funkčnými skupinami. Po naviazaní DNA sa guličky pomocou magnetu oddelia od roztoku s kontaminujúcimi látkami a opakovane sa premyjú. Magnetická separácia je vhodná k automatizácii a používa sa predovšetkým pre spracovanie veľkých počtov vzoriek. Výťažky a čistota DNA sú porovnateľné so silikátovou extrakciou, je však možné izolovanú DNA získať v menšom množstve roztoku (t.j. koncentrovanejšiu).

Špecifické metódy izolácie DNA

Izolácia plazmidovej DNA alkalickou lýzou

Táto metóda sa používa pri izolácii plazmidov z bakteriálnych buniek za súčasného odstránenia chromozomálnej DNA. Bakteriálne bunky sú lyzované v alkalickom prostredí (0,2 M NaOH) v prítomnosti detergentu (1 % SDS). Chromozomálna DNA je pri lýze fragmentovaná na lineárne molekuly, zatiaľ čo plazmidová DNA, ktorá má podstatne menšiu veľkosť, si zachová cirkulárnu formu. Pri pH okolo 12, ktoré je v roztoku, dochádza k denaturácii DNA, t.j. vodíkové väzby medzi bázami sa uvoľnia a vznikajú jednovláknové molekuly. Po neutralizácii roztoku (octanom draselným) kruhová plazmidová DNA renaturuje do pôvodnej dvojvláknovej formy, ale lineárne molekuly chromozomálnej DNA nie sú schopné tak rýchlo renaturovať, a preto agregujú s inými zložkami lyzátu (bunkové steny a membrány, proteíny, SDS).

Purifikácia DNA ultracentrifugáciou v CsCl gradiente

DNA môže byť purifikovaná zo zmesi makromolekúl ultracentrifugáciou za pomoci chloridu cézneho (CsCl) a etídium bromidu. DNA sa skoncentruje do úzkeho prúžku v strede gradientu, pričom lineárna a cirkulárna (plazmidová) DNA majú inú hustotu, a preto je možné ich touto metódou navzájom oddeliť. Po centrifugácii sa vyberú frakcie obsahujúce DNA, etídium bromid sa odstráni extrakciou n-butanolom a DNA sa z roztoku získa etanolovou precipitáciou. Výsledkom tejto techniky je vysokomolekulárna DNA s vysokou čistotou.

Izolácia RNA: Špecifiká a výzvy

Pri izolácii RNA z akéhokoľvek biologického materiálu je hlavným problémom jej nestabilita. Molekula RNA podlieha degradácii oveľa ľahšie ako DNA a zároveň ribonukleázy sú vo všeobecnosti veľmi stabilné a všadeprítomné enzýmy, ktoré nepotrebujú k svojej aktivite ako kofaktory dvojmocné ióny, na rozdiel od DNáz.

Vedeli ste, že...?
RNáza sa skutočne vyskytuje všade. Vylučuje sa aj potnými žľazami na končekoch prstov, takže práca bez rukavíc je absolútne neprípustná.

Metódy izolácie a purifikácie RNA sú založené na rýchlej lýze buniek, ktorá efektívne neutralizuje prítomné nukleázy. Kontaminujúce bielkoviny sa odstraňujú fenolovou extrakciou v kyslom prostredí alebo na silikagélových kolónkach. Zvyšky chromozomálnej DNA je možné rozložiť pôsobením DNázy. Purifikovaná RNA sa využíva na prípravu komplementárnej DNA (cDNA), northernovú hybridizáciu, RT-PCR, alebo na in vitro transláciu. Na prácu s RNA v laboratóriu sú nutné špeciálne pomôcky (skúmavky, pipety a pod.), ktoré sú určené na túto prácu, tzv. RNase free. Vo väčšine prípadov sa roztoky pre prácu s RNA pripravujú z autoklávovanej vody a chemikálií.

Izolácia mRNA

Pri mnohých aplikáciách je výhodné použiť iba frakciu mRNA. V princípe, izolácia mRNA spočíva vo využití prirodzenej enzymatickej posttranskripčnej modifikácie eukaryotickej mRNA, a to je pridávanie poly(A)-chvostíka na 3'-koniec molekuly mRNA za pomoci enzýmu poly(A)-polymerázy. Oligo-dT nosiče sú jednoduché plôšky, na ktorých sú fixované jednovláknové molekuly so sekvenciou poly(T), a teda sú komplementárne k jednovláknovým mRNA s poly(A) koncami. Ak sa roztok s prítomnými mRNA naleje na tieto nosiče, v prostredí s vyššou iónovou silou (pridanie solí) dochádza k hybridizácii, a teda zachytávaniu mRNA na týchto nosičoch.

Optimalizácia a praktické aspekty izolácie

Pri izolácii nukleových kyselín z rastlinných buniek je obzvlášť dôležitá prítomnosť chemických zlúčenín vo vakuolárnej šťave, ktoré môžu proces komplikovať. Vo všeobecnosti sa ťažšie izolujú nukleové kyseliny z rastlinných buniek kvôli prítomnosti kompaktnej celulózovej bunkovej stene a chemických zlúčenín obsiahnutých vo vakuolárnej šťave.

Pre zabezpečenie stability a čistoty DNA je kľúčové použitie vhodných pufrov a podmienok. Optimalizácia elučného roztoku je dôležitá pre maximálnu výťažnosť izolácie DNA. V rámci optimalizácie elučného roztoku Tris-EDTA boli zaznamenané rôzne výťažnosti v závislosti od pH.

Ako je z tabuľky zrejmé, najvyššia výťažnosť (100 %) bola stanovená u roztoku Tris-EDTA o pH 9, zatiaľ čo pri rovnakom roztoku o pH 6,5 bola výťažnosť podstatne nižšia, 36,9 %.

Komerčné súpravy (tzv. kity) pre izoláciu DNA alebo RNA sú navrhnuté tak, aby zjednodušili a štandardizovali proces. Tieto súpravy obsahujú špeciálne roztoky, ktorých zloženie je často predmetom výrobného tajomstva. Tieto súpravy sú navrhnuté na použitie pre rôzne typy vzoriek a poskytujú vysokú účinnosť izolácie.

tags: #kolona #izolacia #dna