Izolácia nukleových kyselín je prvým krokom v mnohých experimentoch molekulárnej biológie. Ideálne je potrebné získať cieľovú nukleovú kyselinu (DNA alebo RNA) v dostatočnom množstve a kvalite, to je bez prímesí „nadbytočných” látok, tzv. kontaminantov. Vo všeobecnosti je v biológii nevyhnutné izolovať čistú, vysokomolekulárnu DNA.
Lýza buniek ako východiskový bod
Výber metódy izolácie záleží od spôsobu, akým sa bude nukleová kyselina v ďalšom postupe analyzovať. Aby došlo k uvoľneniu nukleovej kyseliny do vodného roztoku, je potrebné rozrušiť (dezintegrovať) bunkové steny a biomembrány. V prípade baktérií sa najčastejšie používa enzymatické opracovanie bunkovej steny lyzozýmom, zatiaľ čo živočíšne bunky, ktoré sú obalené len cytoplazmatickou membránou, je možné lyzovať jemnejšími prostriedkami, napr. pôsobením slabých neionogénnych detergentov v kombinácii s proteolytickými enzýmami (napr. proteináza K).
Na uvoľnenie obsahu rastlinných buniek obalených pevnou bunkovou stenou sa používa mechanické ako aj enzymatické opracovanie. Pri lýze sa uvoľní celý obsah buniek do roztoku, pričom vznikne komplexná zmes obsahujúca zvyšky bunkových stien a membrán, proteíny, nukleové kyseliny a polysacharidy.
Purifikácia nukleových kyselín
Princípom purifikácie akéhokoľvek materiálu z buniek je cieľom zbaviť sa zložiek, ktoré pri ďalšej práci nepotrebujeme. K rozpadu bunkových štruktúr prispieva degradácia proteínov pomocou enzýmov proteáz. Na odstránenie proteínov z preparátov nukleových kyselín sa často používa extrakcia organickými rozpúšťadlami, ako sú fenol a chloroform.
Tradičné a moderné metódy extrakcie
- Extrakcia fenol-chloroformom: Táto tradičná metóda využíva organické rozpúšťadlá na oddelenie nukleových kyselín od proteínov. Pri zmiešaní dochádza k denaturácii proteínov, zatiaľ čo nukleové kyseliny zostávajú vo vodnej fáze.
- Metódy na báze silikagélu: Princíp spočíva v tom, že nukleové kyseliny sa viažu na silikagél pri vysokých koncentráciách solí. Po naviazaní sa kontaminanty zmyjú a potom sa nukleové kyseliny eluujú nízkosolným pufrom.
- Čistenie magnetickými guľôčkami: Táto technika využíva magnetické guľôčky, na ktoré sa nukleové kyseliny adsorbujú. Guľôčky sa následne oddelia pomocou magnetu.
Zrážanie a stabilizácia DNA
Na prečistenie nukleových kyselín od nízkomolekulových látok (soli, zvyšky fenolu) a na skoncentrovanie vzorky sa používa alkoholové zrážanie, najčastejšie čistým, bezvodým etanolom alebo izopropanolom v prítomnosti jednomocných iónov. Vyzrážaná nukleová kyselina sa nazýva precipitát. Precipitát DNA sa od roztoku oddelí vysokootáčkovou centrifugáciou. Premytím 70 % etanolom sa odstránia zvyšky solí prítomné v precipitáte a precipitát sa vysuší tak, aby sa odparili zvyšky etanolu, ale zároveň aby DNA zostala hydratovaná.
Molekula DNA v kyslom prostredí môže spontánne degradovať, a preto sa DNA rozpúšťa v slabo zásaditom tlmivom roztoku s prídavkom EDTA (tzv. roztok TE). Pri izolácii RNA je hlavným problémom jej nestabilita a všadeprítomnosť ribonukleáz, preto metódy izolácie RNA vyžadujú veľmi rýchlu lýzu buniek.
| Problém | Príčina | Riešenie |
|---|---|---|
| Fragmentácia DNA | Nadmerná homogenizácia | Jemná homogenizácia pipetovaním |
| DNA kontaminovaná DNázami | Nedostatočná hygiena | Používať rukavice a čisté reagencie |
| Nízky výťažok | Neúplná lýza buniek | Predĺžiť čas lýzy |