Izolácia nukleových kyselín je prvým krokom v mnohých experimentoch molekulárnej biológie. Ideálne je potrebné získať cieľovú nukleovú kyselinu (DNA alebo RNA) v dostatočnom množstve a kvalite, to je bez prímesí „nadbytočných” látok, tzv. kontaminantov. Kvalita templátovej DNA nicméně ovplyvňuje účinnosť amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat.
Ak sa DNA izoluje z buniek, je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů. Aby došlo k uvoľneniu nukleovej kyseliny do vodného roztoku, je potrebné rozrušiť (dezintegrovať) bunkové steny a biomembrány.
Fenol-chloroformová extrakcia: „Zlatý štandard“
Na odstránenie proteínov z preparátov nukleových kyselín sa často používa extrakcia organickými rozpúšťadlami (fenol, chloroform = trichlórmetán). Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA.
Tieto látky sú s vodou nemiešateľné, a preto sa po ich pridaní k vodnému roztoku nukleových kyselín vytvoria dve fázy. Pri pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny.
Postup čistenia
- Homogenizácia a lýza buniek v prítomnosti detergentov (SDS) a proteinázy K.
- Pridanie zmesi fenolu a chloroformu na denaturáciu proteínov.
- Centrifugácia na oddelenie vodnej fázy (obsahujúcej DNA) od organickej fázy (obsahujúcej proteíny a lipidy).
- Precipitácia (zrážanie) DNA pomocou alkoholov (etanol alebo izopropanol) a solí.
- Premytie precipitátu 70% etanolom a rozpustenie v pufri (napr. TE pufer).
Krémová injektáž zdiva proti vzlínající vlhkosti - SANOTECH.cz - sanace a izolace vlhkého zdiva.
Ďalšie metódy purifikácie a alternatívy
Okrem organickej extrakcie existujú aj iné moderné prístupy, ktoré sú vhodnejšie pre automatizáciu:
| Metóda | Princíp | Hlavná výhoda |
|---|---|---|
| Silikátová extrakcia | Väzba DNA na povrch silikátu za prítomnosti chaotropných solí. | Jednoduchosť a automatizovateľnosť. |
| Magnetická separácia | Väzba DNA na magnetické guličky potiahnuté funkčnými skupinami. | Vysoká koncentrácia a rýchlosť. |
| Ultracentrifugácia v CsCl | Separácia podľa hustoty molekúl v gradiente. | Veľmi vysoká čistota DNA. |
Výber metódy izolácie záleží od spôsobu, akým sa bude nukleová kyselina v ďalšom postupe analyzovať. Pri izolácii RNA z akéhokoľvek biologického materiálu je hlavným problémom jej nestabilita. Molekula RNA podlieha degradácii oveľa ľahšie ako DNA a zároveň ribonukleázy sú vo všeobecnosti veľmi stabilné a všadeprítomné enzýmy.
Na odstránenie RNA z preparátov DNA sa používa pankreatická RNáza. Tento enzým je veľmi stabilný a zároveň nevyžaduje pre svoju aktivitu dvojmocné ióny, čo neplatí napr. pre DNázy. Pri izolácii RNA je zas dôležitým krokom odstránenie prímesí genomickej DNA, čo zabezpečí pankreatická DNáza.