Izolácia nukleových kyselín je prvým krokom v mnohých experimentoch molekulárnej biológie. Ideálne je potrebné získať cieľovú nukleovú kyselinu v dostatočnom množstve a kvalite, teda bez prímesí „nadbytočných” látok, tzv. kontaminantov. Kvalita templátovej DNA ovplyvňuje účinnosť amplifikácie v priebehu PCR a nečistoty obsiahnuté vo vzorke môžu polymerázovú reakciu výrazne spomaľovať.
Príprava vzorky a lýza buniek
Ak sa DNA izoluje z buniek, napr. z časočky tkaniva, buniek bukálnej sliznice získaných sterom alebo leukocytov periférnej krvi, je obvykle prvým krokom homogenizácia tkaniva a lýza buniek. V prípade izolácie nukleových kyselín zo živočíšnych tkanív a celých orgánov je potrebná homogenizácia vstupného materiálu. K tomuto účelu je možné použiť mechanické rozdrvenie v homogenizátore alebo rozrušenie bunkovej hmoty zmrazením v tekutom dusíku. Živočíšne bunky sú obalené len cytoplazmatickou membránou, a preto je možné dosiahnuť ich lýzu jemnejšími prostriedkami, napr. pôsobením slabých neionogénnych detergentov v kombinácii s proteolytickými enzýmami.
Na lýzu bakteriálnych buniek sa najčastejšie používa enzymatické opracovanie bunkovej steny lyzozýmom, ktorý hydrolyzuje glykozidické väzby v peptidoglykánoch. Druhým krokom je rozrušenie cytoplazmatickej membrány bakteriálnej bunky pôsobením ionogénnych detergentov, napr. SDS (dodecylsulfát sodný).
Extrakcia a purifikácia DNA
Vzniknutý lyzát obsahuje okrem DNA rad kontaminujúcich látok - všetky nízkomolekulárne i vysokomolekulárne súčasti tkaniva alebo buniek. Kontaminujúce bielkoviny sa hydrolyzujú proteázami a/alebo denaturujú a vysrážajú. Fenol-chloroformová metóda je nejpoužívanější technikou organickej extrakcie DNA. Pri pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zostáva rozpustená vo vodnej fáze, zatiaľ čo proteíny sa denaturujú a vypadávajú do hydrofóbnej fázy. K zmesi sa pridáva malé množstvo izoamylalkoholu, ktorý uľahčí oddelenie fáz a zabráni peneniu pri spracovávaní vzoriek bohatých na proteíny.
Alternatívne metódy izolácie
- Silikátová extrakcia: Využíva sa kremíkových guličiek s veľkým povrchom. Prídavkom vysokej koncentrácie tzv. chaotropných solí pri vhodnom pH dôjde k rozbitiu vodíkových môstkov medzi molekulami vody a povrchom silikátu. Na takto dehydratovaný silikát sa so svojimi fosfátovými skupinami s vysokou afinitou viaže DNA.
- Magnetická separácia: Pri magnetickej separácii sa DNA reverzibilne viaže na magnetické guličky potiahnuté vhodným povrchom. Po naviazaní DNA sa guličky pomocou magnetu oddelia od roztoku s kontaminujúcimi látkami a opakovane sa premyjú. Táto metóda je vhodná k automatizácii a používa sa predovšetkým pre spracovanie veľkých počtov vzoriek.
DNA animation
Zrážanie a finálna úprava
Po odstránení kontaminujúcich bielkovín a lipidov je DNA stále znečistená prevažne nízkomolekulárnymi látkami. Nasleduje preto vysrážanie DNA z roztoku napr. pomocou jednoduchých alkoholov (etanolu alebo izopropanolu). Najprv sa pridá vo veľkej koncentrácii vhodná soľ. Jej ióny si vytvárajú hydratačný obal, čím odojmú DNA rozpúšťadlo (tzv. vysoľovanie). Vysrážená DNA sa premýva v 70 % etanole. Izolovaná a prečistená DNA sa potom spravidla rozpúšťa v alkalickom pufri, ktorý obsahuje etyléndiamíntetraoctovú kyselinu (EDTA).
| Problém | Príčina | Riešenie |
|---|---|---|
| Fragmentácia DNA | Nadmerná homogenizácia | Jemne homogenizovať pipetovaním |
| Nízky výťažok | Neúplná lýza buniek | Predĺžiť čas potrebný na lýzu |
| Kontaminácia | Prítomnosť dnázy | Používať rukavice a čisté reagencie |
Výber metódy izolácie záleží od spôsobu, akým sa bude nukleová kyselina v ďalšom postupe analyzovať. Pri použití metódy PCR postačujú malé množstvá DNA, ktorej čistota a integrita nie sú vo väčšine prípadov kritické. Na druhej strane, pri klonovaní alebo pri sekvenovaní sú potrebné relatívne väčšie množstvá DNA s vyššou čistotou.