Izolácia nukleových kyselín je prvým krokom v mnohých experimentoch molekulárnej biológie. Ideálne je potrebné získať cieľovú nukleovú kyselinu v dostatočnom množstve a kvalite, to je bez prímesí „nadbytočných” látok, tzv. kontaminantov.
Špecifiká izolácie plazmidovej DNA
Táto metóda sa používa pri izolácii plazmidov z bakteriálnych buniek za súčasného odstránenia chromozomálnej DNA. Bakteriálne bunky sú lyzované v alkalickom prostredí (0,2 M NaOH) v prítomnosti detergentu (1 % SDS). Chromozomálna DNA je pri lýze fragmentovaná na lineárne molekuly, zatiaľ čo plazmidová DNA, ktorá má podstatne menšiu veľkosť, si zachová cirkulárnu formu.
Pri pH okolo 12, ktoré je v roztoku, dochádza k denaturácii DNA, t.j. vodíkové väzby medzi bázami sa uvoľnia a vznikajú jednovláknové molekuly. Po neutralizácii roztoku (octanom draselným) kruhová plazmidová DNA renaturuje do pôvodnej dvojvláknovej formy, ale lineárne molekuly chromozomálnej DNA nie sú schopné tak rýchlo renaturovať, a preto agregujú s inými zložkami lyzátu (bunkové steny a membrány, proteíny, SDS).
Extrakcia plazmidovej DNA (tradičná metóda alkalickej lýzy)
Purifikácia a zahustenie
Na prečistenie nukleových kyselín od nízkomolekulových látok (soli, zvyšky fenolu) a na skoncentrovanie vzorky sa používa alkoholové zrážanie (najčastejšie čistým, bezvodým etanolom alebo izopropanolom). Precipitát DNA sa od roztoku oddelí vysokootáčkovou centrifugáciou. Premytím 70 % etanolom sa odstránia zvyšky solí prítomné v precipitáte a precipitát sa vysuší tak, aby sa odparili zvyšky etanolu, ale zároveň aby DNA zostala hydratovaná.
| Produkt | Vstupná vzorka / objem |
|---|---|
| FavorPrep Plasmid DNA Extraction Mini Kit | 1 - 5 ml bunkovej kultúry |
| FavorPrep Plasmid DNA Extraction Midi Kit | 60 - 120 ml bunkovej kultúry |
| FavorPrep Plasmid DNA Extraction Maxi Kit | 120 - 240 ml bunkovej kultúry |
Alternatívne metódy purifikácie
DNA môže byť purifikovaná zo zmesi makromolekúl ultracentrifugáciou za pomoci chloridu cézneho (CsCl) a etídium bromidu. DNA sa skoncentruje do úzkeho prúžku v strede gradiendu, pričom lineárna a cirkulárna (plazmidová) DNA majú inú hustotu, a preto je možné ich touto metódou navzájom oddeliť.
Po centrifugácii sa vyberú frakcie obsahujúce DNA, etídium bromid sa odstráni extrakciou n-butanolom a DNA sa z roztoku získa etanolovou precipitáciou. Výsledkom tejto techniky je vysokomolekulárna DNA s vysokou čistotou.
tags: #izolacia #plazmidovej #dna #peg