Izolácia nukleových kyselín je prvým krokom v mnohých experimentoch molekulárnej biológie. Ideálne je potrebné získať cieľovú nukleovú kyselinu (DNA alebo RNA) v dostatočnom množstve a kvalite, to je bez prímesí „nadbytočných” látok, tzv. kontaminantov. Kvalita templátovej DNA ničméně ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat. Nečistoty reakci zpomalují tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo tím, že se váží na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerasové reakci.
Pri molekulárno-genetickom vyšetrení polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) stačí niekedy ako vzorka veľmi malé množstvo DNA. Preto je dôležité získať DNA v dostatočnom množstve a kvalite, bez prímesí kontaminantov.
Odber vzorky
Bukálny ster pre molekulovo genetické vyšetrenie sa odoberá pomocou sterilnej výterovky. Odberová súprava obsahuje odberový tampónik a nádobku, ktorá neobsahuje žiadne fixačné médium. Vzorky je možné uchovávať pri izbovej teplote alebo pri teplote +2/+8°C. Pred odberom aspoň 14 dní bez antibakteriálneho zásahu napr. chlorhexidínom, resp. priamo pred odberom odporúčame nepoužívať antibakteriálne prípravky (napr. ústne vody). Pred odberom vzoriek by mal byť supragingiválny povlak odstránený a miesto odberu vzoriek by malo byť vysušené.
Vzorka určená na molekulovú analýzu sa odoberá do skúmavky s K3EDTA (ako na krvný obraz: Vacuette a Vacutainer skúmavky s fialovým vrchnákom, Sarstedt skúmavky s červeným vrchnákom). Uskladnenie v chladničke pri teplote 4 -10°C.
Postup izolácie DNA
Pri izolácii DNA z buniek (napr. z částečky tkáně, buněk bukální sliznice získaných stěrem, leukocytů periferní krve), je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů. Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek - všechny nízkomolekulární i vysokomolekulární součásti tkáně nebo buněk.
1. Lýza buniek
Prvým krokom je homogenizácia tkaniva v pufri, ktorý obsahuje tenzid (napr. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí bunkové membrány. Rozpad buniek sa usnadňuje prídavkom proteinázy K. Tento účinný bakteriálny enzým, ktorý má teplotné optimum okolo 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ióny a ktorý neinhibujú ani koncentrované tenzidy, částečně hydrolyzuje kontaminujúce bielkoviny.
Na lýzu bakteriálnych buniek sa najčastejšie používa enzymatické opracovanie bunkovej steny lyzozýmom, ktorý hydrolyzuje glykozidické väzby v peptidoglykánoch. Druhým krokom je rozrušenie cytoplazmatickej membrány bakteriálnej bunky pôsobením ionogénnych detergentov (detergentov tvoriacich ióny), napr. SDS − dodecylsulfát sodný. Nevzácne je treba okrem chemickej lýzy použiť aj mechanickú lýzu bakteriálnych buniek pomocou ultrasonikátora, ktorý na disrupciu buniek využíva ultrazvukové vlny.
Dôležitým faktorom je aj prítomnosť chelatačných činidiel (napr. EDTA − kyselina etyléndiamíntetraoctová), ktoré z roztoku „vychytávajú” dvojmocné katióny (Mg²⁺, Ca²⁺), čím inaktivujú bunkové DNázy. Neprítomnosť dvojmocných katiónov zároveň destabilizuje vonkajšiu bakteriálnu membránu.
Pri lýze sa uvoľní celý obsah buniek do roztoku, pričom vznikne komplexná zmes obsahujúca zvyšky bunkových stien a bunkových membrán, proteíny, nukleové kyseliny, polysacharidy a rôzne nízkomolekulové zložky. Aby nedochádzalo k degradácii izolovanej nukleovej kyseliny je potrebné použiť čo najmiernejšie podmienky lýzy, t.j. uskutočňovať ju v tlmivom roztoku a v chlade.
2. Extrakcia a purifikácia DNA
Následuje preto extrakce a purifikace DNA z lyzátu. Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží. Najčastejšie používaným denaturačným a precipitačným činidlom býva fenol. Vysrážené bílkoviny se poté oddělí vytřepáním do chloroformu a centrifugací. Pričom sa súčasne odstránia aj hydrofóbne součásti zmesi.
Fenol-chloroformová metóda je najpoužívanejšou technikou organickej extrakcie DNA. Hoci je náročnejšia na čas a pracuje sa pri nej s nebezpečnými chemikáliami, umožňuje dosiahnuť vysoké výťažky a získať prakticky čistú DNA. Fenol-chloroformová zmes sa nemieša s vodou. Pri pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zostáva rozpustená vo vodnej fáze, zatiaľ čo proteíny sa denaturujú a vypadávajú do hydrofóbnej fáze. K zmesi sa pridáva malé množstvo izoamylalkoholu, ktorý uľahčí oddelenie fází a zabráni peneniu pri spracovávaní vzoriek bohatých na proteíny.
Medzi výhody organickej extrakcie patrí vysoký výťažok a vysoká čistota purifikovanej DNA. Fenol-chloroformová technika je preto stále „zlatým štandardom“ purifikácie nukleových kyselín. Metóda je ale časovo náročná a pracuje sa pri nej s nebezpečnými chemikáliami. Pri spracovaní veľkého počtu vzoriek sa obtiažne automatizuje. Je tiež treba zaistiť, aby v závere extrakcie boli spoľahlivo odstránené zvyšky fenolu a chloroformu, ktoré by interferovali s naväzujúcimi metódami.
3. Zrážanie DNA
Po odstranění kontaminujících bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná převážně nízkomolekulárními látkami. Následuje proto vysrážení DNA z roztoku např. jejím vysolením nebo pomocí jednoduchých alkoholů (etanolu nebo izopropanolu).
Najprv sa pridá vo veľkej koncentrácii vhodná soľ (chlorid sodný, octan sodný a pod.). Jej ióny si vytvárajú hydratačný obal, čím odojmú DNA rozpúšťadlo (tzv. vysoľovanie). Potom sa k zmesi pridá málo polárna látka (napr. etanol alebo izopropanol). Vyzrážaná DNA sa premýva v 70% etanole. Izolovaná a prečistená DNA sa potom spravidla rozpúšťa v alkalickom pufri, ktorý obsahuje etyléndiaminotetraoctovú kyselinu (EDTA).
Pri izolácii nukleových kyselín zo živočíšnych tkanív a celých orgánov (myšacia slezina, pečeň, mozog) je potrebná homogenizácia vstupného materiálu. K tomuto účelu je možné použiť mechanické rozdrvenie v homogenizátore alebo rozrušenie bunkovej hmoty zmrazením v tekutom dusíku.
Alternatívne metódy purifikácie
Existujú aj iné metódy purifikácie DNA, ktoré sú menej časovo náročné a používajú menej nebezpečné chemikálie.
Silikátová extrakcia
Využíva sa kremíkových guľôčok s veľkým povrchom, ktorými je napríklad naplnená krátka chromatografická kolonka. Vo vodných roztokoch je povrch silikátu hydratovaný. Prídavkom vysokej koncentrácie tzv. chaotropných solí pri vhodnom pH dôjde k rozbitiu vodíkových mostíkov medzi molekulami vody a povrchom silikátu. Na takto dehydratovaný silikát sa svojimi fosfátovými skupinami s vysokou afinitou viaže DNA. Kontaminujúce látky je potom možné odmývať. Extrakcia pomocou silikátovej pevnej fáze je relatívne jednoduchá, hodí sa aj pre automatizáciu.
Magnetická separácia
Pri magnetickej separácii sa DNA reverzibilne viaže na magnetické guľôčky potiahnuté vhodným povrchom - protilátkami proti DNA, silikátom, iónomeničom alebo povrchom s inými vhodnými funkčnými skupinami. Po naviazaní DNA sa guľôčky pomocou magnetu oddelia od roztoku s kontaminujúcimi látkami a opakovaně sa premývajú. Magnetická separácia je vhodná k automatizácii a používa sa predovšetkým pre spracovanie veľkých počtov vzoriek. Výťažky a čistota DNA sú porovnateľné so silikátovou extrakciou, je však možné izolovanú DNA získať v menšom množstve roztoku (tj. koncentrovanejšie).