DNA možno teoreticky izolovať z akejkoľvek živočíšnej tkaniva obsahujúcej živé bunky. Voľba metódy extrakcie DNA závisí od toho, k čomu ju budeme ďalej používať. Kvalita templátovej DNA však ovplyvňuje účinnosť amplifikácie v priebehu PCR a nečistoty obsiahnuté vo vzorke môžu polymerázovú reakciu výrazne spomaľovať.
Ak sa DNA izoluje z buniek, je obvykle prvým krokom homogenizácia tkaniva a lýza buniek. Buněčné a jadrové membrány sa obvykle rozpúšťajú účinkom tenzidov. Vzniklý lyzát obsahuje okrem DNA rad kontaminujúcich látok - všetky nízkomolekulárne aj vysokomolekulárne súčasti tkaniva alebo buniek. Nasleduje preto extrakcia a purifikácia DNA z lyzátu.
Zdroje DNA a špecifiká ich získavania
U obratlovcov, ktorých erytrocyty majú jadro, sa dá DNA ľahko izolovať z krvi. U savcov je izolácia DNA z krvi problematickejšia a vyžaduje pomerne veľké množstvo krve. Pri použití špeciálnych techník je možné izolovať DNA aj z takých zdrojov, ako sú jednotlivé chlupy alebo trus. Často možno izolovať DNA aj z muzejného materiálu, pričom dobrým zdrojom sú hlavne tkanivá uchovávané v liehu.
Naopak, izolácia DNA zo vzoriek, ktoré prišli do styku s formalínom, často končí neúspechom. Pri izolácii tkanív uchovávaných vo formalíne sa v prvých krokoch izolácie niekedy pridáva DTT alebo sa využívajú špeciálne kity.
Tabuľka: Vhodnosť rôznych biologických materiálov na izoláciu DNA
| Typ vzorky | Náročnosť izolácie | Kvalita výťažku |
|---|---|---|
| Krv (vtáky) | Nízka | Vysoká |
| Krv (cicavce) | Stredná | Vysoká |
| Tkanivá v liehu | Stredná | Vysoká |
| Formalínové vzorky | Vysoká | Nízka/Variabilná |
Metódy purifikácie a spracovania
Fenol-chloroformová technika je stále „zlatým štandardom“ purifikácie nukleových kyselín. Metóda je ale časovo náročná a pracuje sa pri nej s nebezpečnými chemikáliami. Pri spracovaní veľkého počtu vzoriek sa obtiažne automatizuje.
Využívajú sa aj moderné alternatívy:
- Extrakcia pomocou silikátovej pevnej fázy: Je relatívne jednoduchá a hodí sa aj pre automatizáciu.
- Magnetická separácia: Je vhodná k automatizácii a používa sa predovšetkým pre spracovanie veľkých počtov vzoriek.
Magnetická separácia s použitím Dynabeads®
Aplikácie v diagnostike
Rozvoj molekulárnej biológie a aplikácie typu PCR v rutínnej diagnostike otvárajú úplne nové trendy aj vo skríningu tumorov GIT. Najnovšie skríningové metódy sú založené na detekcii špecifických mutácií metódami PCR v DNA izolované zo vzorky stolice. Komerčne ponúkané súpravy zaisťujú izoláciu 10 − 30 μg DNA zo vzorky 220 mg stolice počas päťdesiatminútového procesu a odstránenie inhibítorov pre ďalšiu PCR analytiku.
Niekedy možno dokonca použiť priamo časť tkaniva alebo niekoľko buniek lyzovaných napr. hydroxidom, tenzidmi alebo zmrazovaním a rozmrazovaním. Nečistoty reakciu spomaľujú tým, že pôsobia ako inhibitory polymerázy, alebo tým, že sa viažu na templátovú DNA a zneprístupňujú ju tak polymerázovej reakcii.