Fosfor je esenciálny prvok pre rast všetkých organizmov. Naopak, žiadny anorganický fosfor sa nemusí pridávať do krmiva prežúvavcov. Fytát sa vyskytuje ako rezervný zdroj fosforu prakticky vo všetkých kŕmnych hmotách, ktoré pochádzajú z rastlín. Fytát je obsiahnutý v množstve 1-3 % vo všetkých druhoch orechov, obilia, strukovín, olejnatých semenách, spórach a v peli. Komplexné soli kyseliny fytovej sa nazývajú rytín.
Antinutričný Faktor Fytátu a Environmentálne Dôsledky
Kyselina fytová sa pokladá za antinutričný faktor, pretože tvorí cheláty s minerálmi, napr. s vápnikom, zinkom, horčíkom, železom a môže tiež reagovať s proteínmi. Fosfor vo forme fytátu prechádza zažívacím traktom zvierat s jednoduchým žalúdkom a je vylučovaný do mrvy. Hoci v časti hrubého čreva dochádza k istej hydrolýze fytátu, takto uvoľnený anorganický fosfor nemá nutričný význam, pretože sa absorbuje iba v tenkom čreve.
Vylučovanie fosforu vo forme fytátu do mrvy má ďalšie následky. Intenzívny chov dobytka sa počas posledných desaťročí enormne zvýšil. V dôsledku toho sa zodpovedajúcim spôsobom zvýšilo množstvo mrvy, a to spôsobilo ekologické problémy v rôznych častiach sveta. Sójová múka obsahuje veľké množstvo antinutričného faktora, fytátu, ktorý spôsobuje, že tento zdroj bielkovín je nevhodný na použitie v detskej výžive a v krmivách pre ryby, teľatá a iné neprežúvavce.
Farmárska revue - Chov Oviec, Čučoriedkova Plantáž, Malé Kravy - Farmárska revue
Mikrobiálne Fytázy a Ich Potenciál
Enzýmy, produkované mikroorganizmami, ktoré katalyzujú konverziu fytátu na inozitol a anorganický fosfor, sú všeobecne známe ako fytázy. Mikroorganizmy, ktoré produkujú fytázy, sú baktérie, ako napr. Bacillus subtilis a Pseudomonas; kvasinky, ako napr. Saccharomyces cerevisiae; a plesne, ako napr. Aspergillus terreus. Je známe, že aj rôzne iné druhy rodu Aspergillus produkujú fytázu.
Pridávanie mikrobiálnej fytázy do krmiva zvierat s jednoduchým žalúdkom bolo už skôr opísané. Ale až do dnešných čias nebola aplikácia tohto nápadu komerčne uskutočniteľná s ohľadom na vysoké náklady na produkciu mikrobiálnych enzýmov. Ekonomický spôsob produkcie fytázy prinesie významný úžitok okrem iných v krmivárskom priemysle.
Priemyselné Využitie Fytáz
Bolo zistené, že mikrobiálne fytázy majú tiež iné priemyselné použitia. Príkladom takého použitia je priemyselný proces výroby škrobu z obilnín, napr. z kukurice a pšenice. Odpadové produkty, ktoré obsahujú napr. obilný lepok z mokrého procesu mletia, sa predávajú ako krmivo pre zvieratá. Počas máčania sa môže pridať fytáza. Podmienky (t = 50 °C a pH = 5,5) sú pre hubové fytázy ideálne. Fytát chelátuje kovové ióny a to môže spôsobovať nedostupnosť týchto iónov pre produkčné mikroorganizmy. Fytázy sa môžu využívať aj v iných priemyselných procesoch, ktoré používajú substráty, obsahujúce fytát, napr. v škrobárenskom priemysle a fermentačných priemysloch, napr. pivovarníctve.
Výskum a Charakterizácia Fytáz z Aspergillus ficuum
Iní výskumníci sa zaujímali o lepšiu charakterizáciu rôznych fytáz a zlepšenie procedúr produkcie a použitia týchto fytáz. Ullah publikoval postup purifikácie fytázy z divokého kmeňa Aspergillus ficuum a tiež niektoré biochemické parametre produktu získaného týmto purifikačným postupom. Sekvencia aminokyselín N-konca fytázy produkovanej A. ficuum bola dvakrát zverejnená Uliatom. Údaje o sekvencii aminokyselín podľa Ullaha sú uvedené na obr. IA, sekvenciu A a B so sekvenciou C.
Z Ullahových zistení vyplývajú rôzne zaujímavé postrehy. Predovšetkým vyčistený preparát, opísaný Uliatom (1988a, 1988b), poskytuje na SDS-PAGE dva proteínové pásy. My sme však zistili, že vyčistená lytáza z A. ficuum sa odlišuje. Tento rozdiel je tiež zrejmý z údajov o sekvencii aminokyselín, publikovaných Uliatom (1987, 1988b; porovnaj obr. IA, sekvenciu A a B so sekvenciou C).
My sme vlastne určili, že jedna zo sekvencií aminokyselín vnútorných peptidov fytázy, ktoré opísal Ullah (pozri obr. 1B, sekvencia E), v skutočnosti patrí kontaminujúcemu proteínu s molekulovou hmotnosťou 100 kDa (obr. 1C). Tento proteín je obsiahnutý v preparáte získanom postupom podľa Ullaha a na SDS-PAGE je viditeľný ako jeden z dvoch pásov. Následkom prítomnosti tejto kontaminácie sa zvyšuje náročnosť selekcie a izolácie vlastnej sekvencie nukleotidov, ktorá kóduje fytázovú aktivitu.
Po ďalšom skúmaní sekvencie, ako ju opísal Ullah, sme s určitosťou zistili pomocou sekvenačných techník pre bielkoviny a DNA, že aminokyselinový zvyšok v polohe 12, ktorý Ullah určil ako glycín, je v skutočnosti cysteín. Nakoniec Ullah zverejnil, že fytáza je proteín s molekulovou hmotnosťou 85 kDa, po deglykozylácii 61,7 kDa. Táto hodnota, ktorá je oveľa nižšia ako skôr zverejnená hodnota 76 kDa, bola určená na základe relatívneho množstva cukrov uvoľnených pri hydrolýze a zdanlivej molekulovej hmotnosti natívneho proteínu na SDS-PAGE.
Mullaney a ďalší tiež zverejnili charakterizáciu fytázy z A. ficuum. Táto správa tiež obsahuje zmienku o dvoch proteínových pásoch na SDS-PAGE, z ktorých jeden má molekulovú hmotnosť 85 kDa a druhý 100 kDa a ktoré sú prítomné vo „vyčistenom“ proteínovom preparáte. Obidva tieto proteínové pásy boli autormi identifikované ako formy fytázy.
Porovnanie biochemických parametrov fytáz
Porovnanie biochemických parametrov vyčistenej fytázy z divokého kmeňa A. ficuum, ktorú získal Ullah, s ďalšou vyčistenou fytázou z divokého kmeňa A. ficuum, ktorá bola získaná pri tomto vynáleze:
| Parameter | Ullah (údaje) | Tento vynález (údaje) |
|---|---|---|
| Optimálna teplota (napr. pre aktivitu/denaturáciu) | 56,5 °C | 61,7 °C |
| Molekulová hmotnosť (kDa) (natívna)** | 85 | (nie je explicitne uvedené v porovnávacej sekcii) |
| Molekulová hmotnosť (deglykozylovaná) (kDa)** | 61,7 | (nie je explicitne uvedené v porovnávacej sekcii) |
| Izoelektrický bod*** | 5,0-5,4 | 4,5 |
| * Aktivitu fytázy meral Ullah skôr pri 58 °C ako pri 37 °C. Jednotka aktivity fytázy je definovaná ako množstvo enzýmu, ktoré uvoľní anorganický fosfor z 1,5 mM fytátu sodného rýchlosťou 1 pmol/min. pri 37 °C a pH 5,5. Na porovnanie fermentačných výťažkov a špecifických aktivít boli aktivity zistené Ullahom korigované s ohľadom na teplotný rozdiel. ** Molekulová hmotnosť určená na SDS-PAGE. *** Izoelektrický bod je hodnota pH, pri ktorej je celkový náboj molekuly neutrálny. | ||
Metódy Izolácie a Klonovania Génov Fytázy
Jednou metódou produkcie ekonomickejšej fytázy by bolo použitie techniky rekombinácie DNA na zvýšenie úrovne expresie enzýmu v rôznych mikroorganizmoch, ktoré sú známe tým, že produkujú veľké množstvo peptidov a bielkovín. Tento vynález ďalej poskytuje nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú bielkoviny s fytázovou aktivitou a tiež aminokyselinové sekvencie týchto bielkovín.
Klonovanie génov, kódujúcich vybrané proteíny, ktoré sú produkované mikroorganizmami, sa môže uskutočňovať rôznymi spôsobmi. Jednou metódou je purifikácia proteínu, o ktorý je záujem, ďalej určenie sekvencie jeho N-koncových aminokyselín a potom skríning genómovej knižnice daného mikroorganizmu pri použití DNA oligonukleotidovej sondy, ktorá je založená na danej sekvencii N-koncových aminokyselín. Príklady úspešnej aplikácie tohto postupu sú klonovanie génu pre izopenicilín N-syntetázu pri Cephalosporium acremonium a izolácia génu, kódujúceho TAKA amylázu pri Aspergillus oryzae.
Bol vykonaný pokus o izoláciu génu, ktorý kóduje fytázu pri Aspergillus ficuum, týmto postupom. Proteín bol rozsiahlo čistený a boli stanovené niektoré jeho biochemické parametre. Získané údaje sú porovnané s údajmi, ktoré publikoval Ullah (1988a).
Na izoláciu génu kódujúceho fytázu bola zostavená prvá súprava oligonukleotidových sond opísanou metódou (obr. 2A). Zostavenie týchto sond je založené na údajoch o sekvencii aminokyselín. Na kontrolu celého tohto postupu boli podobné kroky urobené pri izolácii génu, kódujúceho kyslú fosfatázu, pričom sa využili existujúce údaje.
Izolácia a klonovanie tejto sekvencie DNA, kódujúcej fytázu, boli vykonané pri použití špecifických, pre tento vynález špeciálne vyvinutých, oligonukleotidových sond. Tento vynález poskytuje sekvencie DNA, ktoré sú schopné hybridizovať za podmienok nízkej stringencie (6 x SSC, 50 °C cez noc) so sondou zahŕňajúcou nukleotidové polohy 1 až 818.
Obr. 4 znázorňuje reštrikčnú mapu bakteriofága lambda AF 201, obsahujúcu lokus fytázy z A. ficuum. Šípka ukazuje umiestnenie fytázového génu a smer transkripcie. Obr. 5 zobrazuje fyzickú mapu pAF 1-1. Fragment 10 kb BamHI, vložený do pUC19, obsahuje celý gén, kódujúci kyslú fytázu z A. ficuum. Obr. 6 predstavuje kompiláciu nukleotidových sekvencií plazmidov pAF 2-3, pAF 2-6 a pAF 2-7, zahŕňajúcu chromozomálny lokus fytázového génu. Oblasť, kódujúca fytázu, je lokalizovaná na nukleotidových pozíciách 210 až 1713; intrón je prítomný v chromozomálnom géne od pozície 254 až k pozícii 355.
Obr. 8 ukazuje sekvencie nukleotidov preloženej časti fragmentu cDNA pre fytázu a odvodená sekvencia aminokyselín pre fytázový proteín; začiatok maturovaného fytázového proteínu je označený ako pozícia +1. Tieto proteíny si zachovávajú fytázovú aktivitu, aj keď nemusia mať prvé štyri alebo sedem aminokyselín zo sekvencie maturovaného fytázového proteínu z A. ficuum.
Vektory, Hostiteľské Organizmy a Expresia Fytázy
Ďalším predmetom tohto vynálezu je vektor, obsahujúci konštrukt na expresiu a ďalej aspoň jednu kópiu prinajmenšom jednej najlepšie homológnej sekvencie DNA, ktorá kóduje fytázu. Ďalším predmetom tohto vynálezu je transformant, najlepšie mikrobiálneho hostiteľa, ktorý bol transformovaný vektorom, opísaným v predchádzajúcom odseku.
Transformovanými hostiteľmi, uvedenými v tomto vynáleze, sú vláknité huby rodu Aspergillus, Trichoderma, Mucor a Penicillium, kvasinky rodu Kluyveromyces a Saccharomyces alebo baktérie rodu Bacillus. Osobitne výhodnými hostiteľmi na expresiu sú vláknité huby rodu Aspergillus.
Obr. 9 predstavuje fyzickú mapu kazety pAF 2-2S na expresiu fytázy. Obr. 12 zobrazuje fyzickú mapu pAB 6-1. Inzert DNA Hindm s molekulovou hmotnosťou 14,5 kb v pUC19 obsahuje celý lokus pre glukoamylázu (AG) z A. niger. Obr. 13 schematizuje generáciu génových fúz AG promótora s fytázovým génom polymerázovou reťazovou reakciou (PCR). Obr. 15 znázorňuje fyzické mapy intermediárnych konštruktov pXXFYTl, pXXFYT2 a kaziet na expresiu fytázy pXXFYT3, v ktorých XX označuje vedúcu sekvenciu (L).
Dôkaz o nadprodukcii fytázy v transformante A. ficuum NRRL 3135 na IEF-PAGE je znázornený na obr. 10. Gély boli farbené buď fosfatázovým farbivom (obr. 10A), alebo obvyklým farbivom na proteíny (Coomassie Brilliant Blue, obr. 10B). Obdobný dôkaz o nadprodukcii fytázy v transformantoch A. niger CBS 513.88 na IEF-PAGE je zobrazený na obr. 11.
Obr. 19 zobrazuje autorádiogramy chromozómovej DNA, štiepenej Pvu Π (obr. 19a) a BamHI (obr. 19b) a hybridizovanej s cDNA. Táto cDNA označená 32P, kóduje fytázu pri A. ficuum a je sondou mikrobiálnych druhov S. cerevisiae, B. subtilis, K. lactis, P. chrysogenum, P. aeruginosa, S. lividans, A. niger a C. thermocellum.
Fytázy "Druhej Generácie"
Sekvencie, ktoré poskytuje tento vynález, môžu byť tiež použité ako štartovacie materiály na konštrukciu fytáz „druhej generácie“. Fytázy „druhej generácie“ sú fytázy, ktoré boli zmenené technikou mutagenézy (napr. mutagenézou cielenou na určité miesto). Majú vlastnosti, ktoré sú odlišné od vlastností fytáz divokých typov alebo rekombinantných fytáz, ktoré sú produkované postupom podľa tohto vynálezu.
Meranie Aktivity Fytázy
Fytázová aktivita sa môže merať pomocou rôznych stanovení. Voľba stanovenia nemá pri tomto vynáleze rozhodujúcu dôležitosť. Na ilustráciu, fytázová aktivita sa môže stanoviť meraním množstva enzýmu, ktoré uvoľní anorganický fosfor z 1,5 mM fytátu sodného rýchlosťou 1 pmol/min. Je potrebné poznamenať, že do rozsahu termínu fytáza, ako sa používa v celom texte tohto opisu, patria všetky peptidy a proteíny s fytázovou aktivitou.
Ekonomický Prínos a Budúcnosť
Výroba fytáz podľa tohto vynálezu zníži výrobné náklady mikrobiálnych fytáz tak, že bude možná ich ekonomická aplikácia v krmivách. To nakoniec povedie k tomu, že pomer ceny a výsledku dosiahnutého s fytázami in vivo bude konkurencieschopný s pomerom dosiahnutým anorganickým fosfátom. Aplikácia cenovo dostupných fytáz, ktoré budú schopné konkurovať anorganickému fosfátu, zvýši mieru voľnosti priemyslu výroby krmivových zmesí pri výrobe kvalitných krmív. Existuje všeobecná prax máčať krmivo počas niekoľkých hodín pred kŕmením, čo môže potenciálne optimalizovať účinok fytáz.
tags: #izolacia #chromozomalnej #dna