Extrakcia proteínov z tkanív a kultivovaných buniek je základným krokom prípravy vzorky, ktorý sa vykonáva počas mnohých biochemických a analytických techník, ako sú ELISA, PAGE, Western blotting, hmotnostná spektrometria alebo purifikácia proteínov. Keďže proteíny obsahujú veľa biologických informácií, extrahujú sa na analytické účely, napr. na proteomický výskum.
Proteomika je oblasť výskumu, ktorá skúma proteíny a proteóm. Proteóm je celý súbor proteínov exprimovaných genómom, bunkou, tkanivom alebo organizmom v určitom čase. Presnejšie povedané, je to súbor exprimovaných proteínov v danom type bunky alebo organizmu v danom čase za definovaných podmienok. Tento termín je zmesou bielkovín a genómu.
Bielkoviny sú veľké biomolekuly, takzvané makromolekuly - ktoré sú zložené z jedného alebo viacerých dlhých reťazcov aminokyselinových zvyškov. Bielkoviny sú prítomné vo všetkých organizmoch rastlinného aj živočíšneho pôvodu a sú kľúčové pre väčšinu biologických funkcií. Medzi najdôležitejšie funkcie, ktoré vykonávajú proteíny, patrí katalýza metabolických reakcií, replikácia DNA, reakcia na podnety a transport molekúl z jedného miesta na druhé. Proteíny sa od seba líšia predovšetkým sekvenciou aminokyselín, ktorá je diktovaná nukleotidovou sekvenciou ich génov a ktorá zvyčajne vedie k zloženiu proteínu do špecifickej trojrozmernej štruktúry, ktorá určuje jeho aktivitu. Bielkoviny sú - okrem peptidov - jedna z kľúčových zložiek jedla.
Typy vzoriek pre izoláciu bielkovín
Tkanivá
Pojem tkanivo opisuje bunkový medziprodukt, kde bunkový materiál je na organizačnej úrovni medzi bunkami a celým orgánom. V tkanive sú zostavené podobné bunky rovnakého pôvodu, ktoré spolu vykonávajú špecifickú funkciu. Vzorky tkaniva sa odoberajú na výskum v biológii, histológii/histopatológii, parazitológii, biochémii, imunohistochémii, ako aj na kultiváciu a extrakciu DNA. Dá sa rozlíšiť medzi živočíšnym (podčlenenie: tkanivo cicavcov) a rastlinným tkanivom. Živočíšne tkanivá sú zoskupené do štyroch základných typov spojivového, svalového, nervového a epiteliálneho tkaniva. Vzorky tkanív sa môžu pripraviť zo živočíšnych alebo rastlinných častí.
Bunkové kultúry
Bunková kultúra je kontrolovaný proces rastu, pri ktorom sa bunky kultivujú za kontrolovaných podmienok. Podmienky bunkovej kultúry sa líšia pre každý typ bunky. Vo všeobecnosti prostredie bunkovej kultúry pozostáva z vhodnej nádoby (napr. Petriho misky) so substrátom alebo médiom, ktoré dodáva základné živiny (aminokyseliny, sacharidy, vitamíny, minerály), rastové faktory, hormóny a plyny (CO2, O2) a reguluje fyzikálno-chemické prostredie (pH pufer, osmotický tlak, teplota). Masové kultúry živočíšnych bunkových línií sa používajú pri priemyselnej výrobe vírusových vakcín a iných biotechnologicky odvodených produktov.
Telesné tekutiny
Krv, sérum, plazma, mozgovomiechový mok, sliny a synoviálna tekutina sú telesné tekutiny, ktoré sú skvelým zdrojom diagnosticky relevantných informácií. Preto je dôležitá sofistikovaná príprava vzoriek telesných tekutín na analýzu.
Príprava vzorky pre izoláciu bielkovín
Disekcia a zmrazenie tkaniva
Na prípravu tkaniva celej veľkosti (napr. obličiek, srdca, pľúc, svalov atď.) by sa tkanivo malo rozpreparovať na veľmi malé kúsky čistými nástrojmi, najlepšie na ľade a čo najrýchlejšie, aby sa zabránilo degradácii proteázami. Po pitve sa vzorka ponorí do kvapalného dusíka na rýchle zmrazenie. Vzorka sa môže skladovať pri teplote -80 °C na neskoršie použitie alebo sa môže uchovávať na ľade na okamžitú homogenizáciu.
Výber lýzneho pufra a detergentov
Lyzačný pufer sa musí zvoliť v súlade s bunkovým materiálom alebo tkanivom (tkanivová kultúra, rastlina, baktérie, huby atď.) a podľa toho, či sú bunky v štruktúre a typu štruktúry. Široká škála lýznych pufrov na extrakciu bielkovín, membrán a organel je formulovaná s jedným alebo viacerými detergentmi. Prací prostriedok sa zvyčajne vyberá prostredníctvom testov pokus-omyl alebo - ak je k dispozícii - podľa existujúceho protokolu extrakcie bielkovín. Prací prostriedok musí byť kompatibilný so zdrojom tkaniva a bielkovinami. Vo všeobecnosti sa najjemnejší prací prostriedok, ktorý funguje na konkrétne tkanivo / proteín, vyberá tak, aby sa zachovala maximálna funkčnosť extraktu. Okrem toho v prípade extrakcie membrán a organel udržuje jemný čistiaci prostriedok membránu neporušenú. Bežne používané čistiace prostriedky v lýznych pufroch sú väčšinou neiónové alebo zwitterionové. Napríklad tkanivá ako mozog, pečeň, črevá, obličky, slezina atď. môžu byť jednoducho pufrované pomocou RIPA - mali by sa však zahrnúť inhibítory proteázy a DTT.
Bezprostredne pred ultrazvukovou extrakciou sa do skúmavky na vzorku rýchlo pridá ľadovo studený lýzny pufer (s inhibítormi proteázy DTT, leupeptínom a aprotinínom) (na ~10 mg tkaniva sa odporúča približne ~ 600 μl pufra).
TRIzol metóda
TRIzol je chemický roztok používaný na extrakciu RNA/DNA/proteínu počas extrakcie guanidíniumtiokyanátu-fenol-chloroformu. Simões, André E.S. a kol. (2013) demonštrovali efektívne získavanie proteínov z viacerých zdrojov vzoriek po extrakcii RNA pomocou TRIzol alebo TRIzol LS a dlhodobom skladovaní.
Homogenizácia a lýza
Regulácia teploty: Aby sa zabezpečil vysoký výťažok bielkovín bez tepelnej denaturácie, musí sa počas extrakcie regulovať teplota. Extrakcia proteínov sa vykonáva sonikáciou v cykloch (pulzačný režim) a umiestnením vzorky na ľad, aby sa zabránilo prehriatiu a tepelnej degradácii vzorky.
Ultrazvuková homogenizácia, lýza a extrakcia sa vykonáva pomocou ultrazvukového homogenizátora, ako je UP100H alebo UP200Ht, vybaveného sonotródou s mikrohrotom. Trvanie sonikácie je 60-90 sekúnd v režime ultrazvukového cyklu 15 sekúnd sonikácie a 10 sekúnd odpočinku. Sonikácia môže urýchliť proces solubilizácie bielkovín, ktorý zvyčajne vyžaduje niekoľko hodín.
Studená obalovaná asfaltová směs DenBit RB
Špecifiká pre rôzne typy vzoriek pri ultrazvukovej lýze:
- Živočíšne tkanivá: Po ultrazvukovej homogenizácii / extrakcii sa lyzát odstredí pri 27 000 g po dobu cca. 20 min.
- Homogénna zmes séra a fosfátového pufra: Vzorka sa najskôr víruje pred ultrazvukovou lýzou buniek. Na ultrazvukovú lýzu sa vzorka sonikuje ultrazvukovým laboratórnym homogenizátorom, ako je UP100H, počas 8 cyklov pri 20% amplitúde, pre cykly každých 5 sekúnd zapnutých a 15 sekúnd vypnutých.
- Čerstvé, mäkké rastlinné tkanivo (napr. mach): možno ľahko narušiť jednoduchým umiestnením nasekaného vzorkového materiálu do lyzačného pufra na sonikáciu.
- Tvrdé, ligenózne rastlinné tkanivá (ako sú semená, jedľové ihličie): by mali byť mleté nasucho. Niektoré tvrdé drevité rastlinné materiály musia byť pred extrakciou sonikáciou zmrazené a rozomleté v tekutom dusíku.
- Suspenzie rastlinných bunkových kultúr: Väčšinou postačuje ultrazvukové ošetrenie medzi 30 a 150 sekundami v lýznom pufri.
Ultrazvukové homogenizátory Hielscher
Najmodernejšie ultrazvukové homogenizátory Hielscher - tiež nazývaný ultrazvukový dezintegrátor alebo ultrasonizátor - sú presne ovládateľné. Dodávajú sa so zásuvným snímačom teploty. V možnostiach nastavenia ultrazvukového homogenizátora je možné nastaviť maximálnu teplotu. Laboratórne ultrazvuky Hielscher sú výkonné a ľahko ovládateľné. Sú navrhnuté pre prevádzku 24 hodín denne, 7 dní v týždni a sú navrhnuté ako robustné a efektívne laboratórne a stolové zariadenia. Pre všetky zariadenia je možné presne regulovať energetický výkon a amplitúdu. Široká ponuka príslušenstva otvára ďalšie možnosti nastavenia.
Tento návod vysvetľuje, aký typ sonikátora je najlepší pre vaše úlohy prípravy vzoriek, ako je lýza, narušenie buniek, izolácia proteínov, fragmentácia DNA a RNA v laboratóriách, analýza a výskum. Vyberte si ideálny typ sonikátora pre vašu aplikáciu, objem vzorky, počet vzoriek a priepustnosť.
Nasledujúca tabuľka poskytuje prehľad našich ultrazvukových prístrojov na prípravu vzoriek, narušenie buniek a extrakciu. V závislosti od vašej aplikácie, materiálu a objemu vzorky vám odporučíme najvhodnejšie nastavenie pre prípravu vzoriek.
| Typ zariadenia | Aplikácia | Objem vzorky |
|---|---|---|
| UP100H | Lýza, narušenie buniek, izolácia proteínov | Malé objemy |
| UP200Ht | Lýza, narušenie buniek, izolácia proteínov | Stredné objemy |
| UP400St | Extrakcia albumínu, regulácia teploty | Väčšie objemy |
| UIP400MTP | Príprava vzoriek z viacjamkových platničiek | Vysoká priepustnosť |
Video ukazuje ultrazvukový systém prípravy vzoriek UIP400MTP, ktorý umožňuje spoľahlivú prípravu vzoriek akýchkoľvek štandardných viacjamkových platničiek pomocou ultrazvuku s vysokou intenzitou.
Konkrétne protokoly pre izoláciu bielkovín
Ultrazvuková extrakcia albumínu z tekvicových semien
Na ultrazvukovú extrakciu proteínu albumínu z jemne mletého prášku z tekvicových semien sa do sklenenej kadičky s objemom 250 ml pridá 10 g odtučneného prášku z tekvicových semien a 100 ml deionizovanej vody ako rozpúšťadlo. Extrakcia proteínu pozostáva z dvoch krokov: Po prvé, vzorka sa sonikuje ultrazvukový ultrazvuk sondového typu UP400St (400W, 24kHz) vybavený sonotródou S24d7. Sklenená kadička sa počas ultrazvukovej homogenizácie umiestni do studeného vodného kúpeľa. Zásuvný snímač teploty a nastavenia regulácie teploty ultrazvuku UP400St zaisťujú, že teplota vzorky je vždy udržiavaná pod 30 °C. Presnou reguláciou teploty počas sonikácie sa zabráni denaturácii albumínu. Po druhé, extrakcia sa vykonávala mixérom pri otáčkach 200 ot./min a pri 30 °C. Potom sa kadička prenesie do termostatickej trepačky. Globulín sa odstraňuje dialýzou destilovanou vodou. Po odstránení globulínu sa môže odobrať vzorka proteínového extraktu na stanovenie albumínového profilu a následne sa upraví na pI=3,0 s použitím 0,1 M HCl na koaguláciu albumínu. Pevná fáza sa oddelí centrifugáciou pri 5000 g, 20 °C a znovu sa rozpustí v deionizovanej vode.
Extrakcia funkčného enzýmu iNOS
Na získanie plne funkčného enzýmu iNOS (napr. na skríning liekov) sa odporúča nasledujúci protokol: Bunková suspenzia by sa mala umiestniť na ľad a sonikovať UP100H pri amplitúde 10 μm v cyklickom režime 5 sekúnd sonikácie a 25 sekúnd odpočívať na ľade. Postup by sa mal opakovať cca. 3-krát.
Analytické techniky a detekcia bielkovín
Stanovenie koncentrácie bielkovín
Bradfordov test, Lowryho test a test kyseliny bicinchoninovej (BCA) sú bežné testy na stanovenie koncentrácie proteínov.
Gélová elektroforéza
Gélová elektroforéza je hlavnou metódou separácie a analýzy makromolekúl, ako sú DNA, RNA a proteíny, ako aj ich fragmentov, na základe ich veľkosti a náboja.
Extrakcia bodu zákalu (Cloud Point Extraction)
Cloud Point Extraction je predanalytický postup na separáciu a predbežnú koncentráciu analyzovaných látok. V kombinácii s ultrazvukom je možné zintenzívniť extrakciu bodu zákalu, čím sa proces stáva efektívnejším, rýchlejším a šetrnejším k životnému prostrediu. Pri ultrazvuku je extrakcia bodu zákalu podstatne efektívnejšou metódou prípravy analytu. Chittapalo T, Noomhorm A (2009) študovali ultrazvukom asistovanú alkalickú extrakciu bielkovín z odtučnených ryžových otrúb a vlastnosti bielkovinových koncentrátov.
Kvalitatívne testy na detekciu bielkovín
Makromolekulu bielkovín tvorí reťazec aminokyselín. Farebné reakcie spôsobujú radikály, ktoré sa na peptidových väzbách nezúčastňujú, preto tieto reakcie nie sú prísne špecifické.
Biuretová reakcia
Názov "biuretová reakcia" je odvodený od biuretu, ktorý vzniká zohrievaním močoviny, pričom sa uvoľňuje amoniak. Skúmaný extrakt sa sfarbí na červeno (príp. až na purpurovo).
Pre ilustráciu: Olúpaný surový zemiak postrúhajte a v roztieračke roztierajte niekoľko minút. Kašovitú masu vložte do handričky a vytlačte z nej kalnú šťavu. Do 2 cm3 extraktu pridajte 1 cm3 kyseliny dusičnej HNO3. Roztok zahrejte.
Xantoproteínová reakcia
V molekule bielkovín sú viazané aromatické aminokyseliny (tyrozín, tryptofán, fenylalanín) s benzénovým jadrom. Jadro sa kyselinou dusičnou HNO3 nitruje za vzniku na žlto sfarbených zlúčenín.
